壳寡糖对铁皮石斛原球茎生长及多糖含量的影响 毕业论文.docVIP

壳寡糖对铁皮石斛原球茎生长及多糖含量的影响 【摘　要】以铁皮石斛原球茎为原材料，通过在含不同浓度壳寡糖的培养基中培养后，研究壳寡糖对铁皮石斛的原球茎增殖及其多糖含量的影响。结果表明在较低的壳寡糖浓度下，壳寡糖促进铁皮石斛多糖的含量的积累，则高浓度则抑制其多糖的增加。实验中，铁皮石斛的生长量随着壳寡糖浓度的升高而减少，在0.1mg/L的壳寡糖浓度下，其多糖含量最高达30.84%，超过0.1mg/L则多糖含量减少。 【关键词】铁皮石斛；原球茎；壳寡糖；苯酚-硫酸法；多糖含量 铁皮石斛Dendrobium candidum Wall.ex Lindl 为兰科石斛属植物，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功能，用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明，是我国重要的出口药材之一。铁皮石斛主要成份是多糖，还含有少量的单糖，生物碱，氨基酸，酚类，挥发油等[1-2]。由于目前资源，价格昂贵，有许多的人已经开始了人工繁殖。历史上，已经有许多人对铁皮石斛多糖含量进行过测定，如黄民权从愈伤组织中提取多糖[3]。铁皮石斛有三种多糖，它们为一类O一乙酰葡萄甘露聚糖．铁皮石斛多糖的药理作用广泛，主要有增强免疫力、抗肿瘤、降血糖等作用[4]。壳寡糖用大、生物活性高的低分子量产品，较壳聚糖具有更高的溶解度、更容易被生物体吸收等功能 [5]。壳寡糖可作为植物生长调节剂，增强植物对病虫害的防御能力[6]，促进次生代谢产物的积累,具有杀菌菌活性（抗菌、抑菌）[7]，提高杀虫活性与趋避活性[8]等。本研究主要探讨在铁皮石斛原球茎组培过程中壳寡糖对原球茎生长以及多糖含量的影响，为石斛生物制药生产和积累次生代谢产物的配方优化提供依据。 1 材料与仪器 1.1 材料 铁皮石斛原球茎：由组培室提供培养；壳寡糖：购于浙江金壳生物化学有限公司，产品批号为D120510097，分子量为100万；6-BA、NAA：国药集团化学试剂有限公司；石油醚、无水乙醇、丙酮、乙醇（95％、80％）、0.1％活性炭、苯酚、铝片、NaHCO3、培养室，超净工作台，高压灭菌锅，培养皿，解剖刀，容量瓶，移液管天平，剪刀，棉线，纸[9]测定多糖含量。 2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，用蒸馏水溶解并定容到100mL。 2.2.2 多糖提取 取干燥样品，精密称定适量，经石油醚回流脱脂约1 h，过滤，挥去石油醚，以80％乙醇回流提取1 h，乘热过滤，将滤渣加水回流提取1 h，乘热过滤，滤液浓缩，加入0.1％活性炭脱色，过滤，加入95％乙醇使溶液含醇80％，静置过夜，过滤，以无水乙醇、丙酮依次洗涤8次，所得多糖于60℃烘干备用。 2.2.3 苯酚溶液的配制 5 %苯酚试剂的配制：取苯酚100 g，加铝片0．1 g和NaHCO3 0.05 g，蒸馏，收集172～182℃馏分，称取2.5 g，加水50 mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。 2.2.4 测定波长的选择 精密量取葡萄糖对照品溶液1．0mL、样品溶液1.0mL，各加新配制的5％ 苯酚液1.0mL，混匀，迅速滴加浓硫酸5mL，摇匀，置40℃水浴中放置15min，取出，冷却至室温。另取1.0mL蒸馏水同法平行操作作为空白对照，根据紫外-可见分光光度法[10]，于600～400nm范围内扫描其吸收曲线。 2.2.5 标准曲线制作 精密称取干燥至恒重的葡萄糖50mg置烧杯中溶解后，于50ml容量瓶中定容，加蒸馏水适量使溶解，稀释至刻度，摇匀。精密量取5 ml溶液置50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，为标准品溶液。精密量取标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分别置试管中，各加蒸馏水至2．0 ml，再加5%苯酚试液1．0 ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 ml，迅速摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出，冷水迅速冷却至室温，以蒸馏水作为空白对照。于2.2.4中测出的波长处测定吸光度，然后绘制标准曲线。 2.2.6 石斛多糖与葡萄糖换算因素的确定 精密称取干燥至恒重的多糖样品2．5 mg，置于25 ml容量瓶，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，作贮备液。精密吸取该贮备液1.0ml按标准曲线项下操作。求得的回归方程，算出对应浓度，再按下式计算换算因素： f=多糖重量/[多糖液的葡萄糖浓度(mg／mL)x多糖的稀释倍数] 2.2.7 待测样品石斛多糖的测定 精密称取铁皮石斛原球茎的干燥粉末，各加80％乙醇100 ml，回流提取1 h，稀释过滤，药渣用8 ml80％热乙醇洗涤3次，加蒸馏水80 m1，回流1 h，乘热过滤，再用5 ml热水洗涤烧瓶和药渣，一并置于100 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀置冰箱中备用。精密吸取1.0 ml按标准曲线项下操作，求出各多糖液中葡萄糖浓