第五分子生物学研究法(上).ppt

分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术 加标准分子量DNA Marker,测定分子量 加标准浓度的DNA，测定浓度 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。 在生理条件下，DNA电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 000~1 000 0.7%琼脂糖 20 000~1 000 1.4%琼脂糖 6 000~300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000~100 10.0%聚丙烯酰胺 500~25 20.0%聚丙烯酰胺 50~1 图5-4 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。 凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭对核酸分子进行染色，紫外光下发荧光。 每条DNA带中仅含0.05μg微量DNA，也可以被清晰地检测出来。 图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图 5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。 细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。 图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选 为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。 CaCl2法 将快速生长期大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。 将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。 转化效率可达到5×106~2×107个转化子/μg超螺旋质粒DNA。 电击法 电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。 将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4℃后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。 获得最大转化效率时场强一般为12.5~15kV/cm，时间跨度一般为4.5~5.5毫秒。 电击转化与温度有关，一般在0~4℃进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。 5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。 图5-7 聚合酶链式反应（PCR）技术 图5-8 PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较 1989年12月， 著名的自然科学杂志“SCIENCE”将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 主编Daniel Koshland Jr. 写道：第一篇有关PCR的论文发表于1985年。自那以后，PCR已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。…… 有了PCR，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。 * 第五章 扉页： 当你进入实验室时，要像