第九分子标记.ppt

Chapter 9 Molecular Marker 分子标记概念的界定 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。 本章中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。 理想的分子标记的界定 理想的分子标记必须达到以下几个要求： (1)具有高的多态性； (2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型； (3)能明确辨别等位基因； (4)遍布整个基因组； (5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； (6)选择中性（即无基因多效性）； (7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）； (8)开发成本和使用成本尽量低廉； (9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交 换）。 分子标记技术的分类 第一类：以分子杂交为核心的分子标记 技术 第二类：以聚合酶链式反应为核心的分 子标记技术 第三类：新型的分子标记技术 第一节 以分子杂交为核心的分子标记技术 (一) DNA指纹技术（DNA Fingerprinting） (二) 原位杂交（in situ hybridization） Southern印迹 在20世纪60年代，Southern首先发现卫星DNA由很多短的重复片段串联在一起。 与此同时， Ham Simth 发现的Ⅱ型核酸内切酶。 southern纯化EcoRⅡ。 Southern用EcoRⅡ酶切卫星DNA，电泳后凝胶中出现了梯状条带（ladder）。 他将5S rRNA基因组DNA通过一种或几种限制酶消化后，通过琼脂糖电泳按照大小分离，然后将DNA经过原位变性后，转移到硝酸纤维膜上，再与有放射性标记的5S rRNA杂交，通过放射性自显影确定了5S RNA基因在基因组上的位置。 1987年用southern blotting方法发现，在美国黑人中，导致镰刀型红细胞贫血症的β－球蛋白突变，在其基因在酶切位点附近有多态性，该发现使得可以使用southern blotting检测DNA来直接地跟踪疾病相关基因。——限制片断长度多态性（RFLP） 随着人类基因组计划的开展，southern开发出了寡核苷酸微阵列（oligonuleotide arrays） 限制性片段长度多态性标记(Restricton fragment length polymorphism, RFLP) RFLP—特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全水解后，产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。 凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一般DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。 RFLP标记的主要特点 遍布于整个基因组，数量几乎是无限的; 无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制； 结果稳定、可靠； DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。 1980年Wyman等发现了在未知的物理图谱位置存在高度可变的多等位基因位点。 Jeffreys在分析球蛋白基因家族的myoglobin时发现在其基因内部有一个小卫星DNA序列，并且它们的重复特征和其他基因中发现的序列具有相似性。 然后Jeffreys用这些发现的小卫星序列来筛选人类基因组文库，分离得到了其它的一些可变基因座。测序后发现：这些小卫星序列共有一个10-15bp的基序（motif）。 Jeffreys又利用southern blotting的方法将这些小卫星序列和来自不同物种的基因组DNA 片断进行杂交，发现甚至在一个家庭中这些DNA的特征也是高度可变的。 数目可变的串联重复多态性（ Varible number of tandem repeats，VNTR） VNTR—一类叫小卫星DNA（minisatellite DNA），其核心序列长11～16bp，多存在于异染色质区域（如端粒、随体、基因非编码区）；另一类叫微小卫星DNA或微卫星DNA（microsatellite DNA），其核心序列长仅2～5bp，故亦称为STR（短串联重复，short tandem repeat），广泛分布于基因组中。 凡是核心序列相同的VNTR属于一种VNTR，尽管它们的长度、重复次数和分布位点可能不一样。 VNTR的主要特点 在人群中呈现出高度的多态性，即不同的人，同一种VNTR在染色体上的分布、数目和长度