大鼠肝细胞原代培养模型的研究.ppt

大鼠肝细胞原代培养模型的研究 摘要 目的: 为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型, 并鉴定肝细胞的功能。 方法: 在传统的两步灌流法的基础上代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况。 结果: 分离得到的肝细胞成活率可达90% 以上, 纯度 可达95%以上; 流式细胞术结果表明原代肝细胞大 多处于G0、G1 期, 且基本无凋亡 。 结论: 体外培养的肝细胞活力和纯度均较高, 体外培养后细胞功能正常, 是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型。 关键词 ：大鼠; 肝细胞; 原代培养; 细胞模型; 中图分类号: R965. 1 文献标识码: A 文章编号: 1009-2501( 2005) 07-0743-0 1 材料与方法 1. 1 主要材料 SPF( special pathogen free) 级雄性Sprague-Dawley 大鼠, 体重150~ 200 g。 1. 2 大鼠原代肝细胞培养和细胞纯度及活率鉴定 以0. 6% 戊巴比妥钠麻醉大鼠, 开腹, 分离肝门静脉, 经门静脉插管, 开放下腔静脉, 以流速5ml／min- 1灌流500 ml 37 ℃ 的前灌流液( 142 mmolNaCl、6. 7mmol KCl、10 mmol HEPES、pH 7. 4) , 冲洗肝脏中的血液。将肝脏完整分离下来, 转入自制的循环灌流杯中, 以37 ℃预热的0. 1% IV 胶原酶循环灌流10 min, 流速4 ml#min- 1。当肝包膜下肝组织呈龟背状裂隙、胶原酶灌流液充满肝包膜下时停止。去除肝包膜, 分离肝细胞, 置于37 e度低速振荡10 min 过150 目筛, 以清洗液清洗细胞, 50 g 离心5 min 3 次获取肝细胞。细胞计数, 台盼蓝染色计数细胞活率。将细胞以105 个Pml 浓度接种于96孔板中, 37 ℃ 、5 % CO2、100% 湿度条件下培养24 h,换液去掉未贴壁的细胞, 以后每24 h 换液1 次。取部分细胞离心收集, 20% 甲醛固定, 常规HE 染色后, 镜下计数每视野的肝细胞来计算细胞纯度。／ 1. 3 流式细胞术测定细胞周期 将分离下来的肝细胞以800 r／min离心5 min, 收集细胞, PBS 洗2次。冰浴下加入- 20 度预冷的70% 的乙醇( PBS 稀释) , 放置4 ℃过夜。14 000 g , 短时离心, 弃上清, 去除乙醇, PBS 洗2 次。以500 Ll PBS 重悬细胞, 加RNase A 至终浓度为20 mg／L, 于37 e℃孵育30 min。置于冰上, 加PI( Potassium iodide) 至终浓度为50 mg／L,冰浴30 min, 流式细胞仪检测细胞荧光, CellQuest软件包分析数据, 计算原代大肝细胞细胞周期的比率。 1. 4 流式细胞术测定细胞凋亡 根据Annexin VPPI双标试剂盒说明书操作, 将分离下来的肝细胞调整细胞浓度为 105~ 106 个Pml; 取1 ml 细胞液,4 度, 1 000 r／min 离心10 min, 弃上清; 加入1 ml 预冷的PBS, 轻轻震荡, 重悬细胞; 4 度 , 1 000 r／min离心10 min, 弃上清; 重复步骤离心2 次; 将细胞重悬于200 Binding Buffer 中; 加入10 Ll Annexin VFITC和5 Ll PI, 轻混匀, 避光室温反应15 min; 加入300 Ll Binding Buffer, 在1 h 内上机检测。 5 统计学处理 实验数据以均数“加减 ”标准差( x ±s ) 表示, 应用SPSS 11. 0软件分析, 各组之间显著性比较采用单因素方差分析( one-way ANOVA)。 2 结果 2. 1 原代肝细胞培养存活率和纯度 所分离的肝细胞以台盼蓝拒染法检测细胞成活率平均达90%以上; 将肝细胞1 000 r／min离心沉淀, 20% 甲醛固定, 常规HE 染色观察。肝细胞纯度鉴定的结果显示, 本实验中分离的肝细胞纯度可达95% 以上, 细胞核蓝染, 细胞外形呈多角形, 胞体较大, 大部分是单核, 也有双核的细胞, 适合用于进一步的实验研究。( 图1) 图1 大鼠肝细胞( HE染色) 2. 2 原代肝细胞细胞周期和细胞凋亡 PI 染色, 流 式细胞术测定结果表明, 处于G0、G1 期的肝细胞占 总细胞数的90. 62%, 说明原代肝细胞大部分处于 非增殖状态; 采用Annexin V 和PI 双标记、流式细胞