第八章蛋白质和氨基酸的测定详解.ppt

第一节 概述 ?1.蛋白质的元素组成（The elements of protein） C：50-55% N：15-18% O：20-23% H：6-8% S：0-4% 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。 4、蛋白质分析的重要性 生物活性测定 功能性质调查 营养标签 总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值 5、蛋白质的测定方法 利用蛋白质共性的方法 利用特定氨基酸残基法 第二节 蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法） 蛋白质的测定方法 1凯氏定氮法（1833年Kieldahl,常量法、微量法、自动定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法） 2双缩脲法 3福林酚（Lowry）法 4 Bicinchoninic Acid 法 5 280nm紫外吸收法 6染色法 6.1阴离子染色法 6.2布兰德福特（Bradford）法 7茚三酮法 8比浊法 9杜马斯法（燃烧法） 10 红外光谱法 一、凯氏定氮法（常量） 凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白含量。 此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 原理 样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白质分解，其中C,H氧化为CO2和H2O，有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。 样品制备 消化 中和、蒸馏 滴定 计算 利用换算系数可以把氮的百分含量转化成样品粗蛋白质含量。由于大部分蛋白质含有16%的氮，所以其换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。 即： %N × 6.25 = %蛋白质 在消化反应中,为了加速蛋白质的分解,缩短消化时间,常加入下列物质 1）硫酸钾: 提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在340℃左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400℃以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解,水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高,其反应式如下： K2SO4 + H2SO4 → 2KHSO4 2KHSO4 → K2SO4 + H2O↑+ SO2 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起引起生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。 除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。 （2） （催化剂、指示剂）硫酸铜 起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。 指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。指示蒸馏时的碱加入量是否足够。 除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等也可用的催化剂。 操作步骤 消化 准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g，液体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→安装消化装置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角斜支于有小孔的石棉网上→用电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡沫停止后→加大火力保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明→继续加热微沸30分钟→冷却→ 定容。 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。 蒸馏 吸取5mL稀释后的消化液→加入凯氏定氮仪内→加10mL40%的氢氧化钠→夹好漏斗夹→冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预先装入10ml4%硼酸溶液及混合指示剂) →加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约10分钟) →将冷凝管下端提离液面→用蒸馏水冲洗管口→继续蒸馏1分钟→加热。 滴定 将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色（用甲基红－溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同时作一试剂空白。 计算 Page 158 公式 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3ml后再继续消化。 一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸