分子生物学实验要点.doc

华中科技大学生命科学与技术学院 分子生物学实验报告 专业 班级 姓名 学号 日期 成绩 实验一 质粒的小剂量提取——碱裂解法 实验原理： 质粒(Plasmid)是独立于细菌染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种环状的双链DNA分子，大小为1-200千碱基对(kb)，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多，在细胞中一般以游离超螺旋状存在。质粒具有自主复制性、不相容性、多拷 贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切酶单一识别位点等特点。它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。 质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“严谨型”；二是“松驰型”。 1.严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 2.松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。 质粒的提取有多种方法。本实验采用碱裂解法 进行质粒的小量制备。碱裂解法是常用的质粒的小剂量提取法，它的原理是：在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将pH中和至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。上清液中的质粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀 1、掌握碱裂解法提取质粒的基本原理。 2、掌握碱裂解法的实验操作及各种试剂的配制方法及作用。 3、学习质粒的基本结构 实验试剂与器材： （一）实验试剂： 1、LB培养基 蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，待用纯水完全溶解后，用1N NaOH调pH至7.3左右，15Ibf/in2高压蒸气灭菌20分钟。固体培养基则添加15g/L琼脂。 2、卡纳霉素：100mg/ml，工作液为100ug/ml。 3、溶液（pH8.0）：取1.982 g葡萄糖、4 ml EDTA（0.5 mol/L，pH8.0）、5 mlTris-Cl（1mol/L，pH8.0），加双蒸水定容至200 ml，高压灭菌20 分钟，于4保存。 （50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后存放。） 溶液：取2 ml NaOH（10 mol/L稀释）、10 ml SDS（10%），加双蒸水定容至100 ml，室温使用，现配现用。 （0.2mol/L NaOH， 1% SDS（m/V）） 溶液：29.4 g乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，加双蒸水定容至100 ml。 （5mol/L 乙酸钾 60ml，冰乙酸11.5 ml，水28.5ml。所配成的浓度中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。保存于4度，用时置于冰浴中。） 6、酚/氯仿/异戊醇液(V/V/V＝25/24/1)：配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，再将Tris平衡酚与之等体积混合，4保存，1月内有效。 7、TE缓冲液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT 8、RNase 1mg/ml：称10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，此液为10mg/ml RNase浓度，应用时稀释至1mg/ml。 9、70％乙醇、无水乙醇 10、分别含有pEGFP-C1质粒以及CMV-UXT质粒的大肠杆菌DH5α （二）实验仪