分子生物学实验指导书_new要点.doc

实验指导书 院系： 生态与资源工程系 专业： 生物工程 课程： 分子生物学 编者： 生物工程教研室 目 录 实验一 植物总DNA的提取 3 实验二 DNA琼脂糖凝电泳定量及质量检测 6 实验三 PCR扩增获取目的基因 9 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 10 实验一 植物总DNA的提取 一、实验目的： 通过实验学习和掌握植物总DNA提取和纯化的原理和方法，并为后续的实验准备DNA样品。 二、实验原理与方法： 2.1 DNA提取的原理 植物组织中总DNA的提取首先要破碎细胞。植物细胞具有坚硬的细胞壁，液氮冷冻和研磨是破碎植物细胞壁的有效方法。而细胞膜、核膜等膜体系的破坏则通过加入提取缓冲液中的去污剂的处理来实现。常用的去污剂有SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)，CTAB(cetyltrimlthylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵)等。细胞壁、细胞膜及核膜破坏后，释放出细胞内含物至提取缓冲液，内含物中包括DNA、RNA和蛋白质等。将其他组分除去或降解，然后回收DNA是常采用的一种提取和纯化DNA的技术路线。磨碎的植物组织经提取缓冲液处理后通过离心可沉淀植物组织残渣至试管底部，取上清液、弃残渣，上清中加入苯酚和氯仿（三氯甲烷）处理后经离心蛋白质沉淀于有机相（下相）和水相（上相）的界面处。水相中含有溶解的DNA和RNA,收集水相加入核糖核酸酶A(ribonuclease A ， RNaseA)则使RNA降解，而DNA仍完整。加入乙醇或异丙醇可使DNA呈絮状沉淀析出，絮状沉淀可用玻棒或牙签缠绕挑出或通过离心收获，并重新溶解于适量的TE缓冲液中备用。 2.2 DNA提取的质量要求 对DNA提取样品的基本质量要求是尽量保持DNA分子的完整性（即没有或很少降解）和样品的高纯度（即蛋白质和RNA等的污染程度低）。但对DNA样品的质量要求程度的高低依DNA样品用途而定。 2.2.1 导致DNA降解的因素及对策 ①物理因素：机械剪切力和高温。 对策：DNA样品制备时要求动作轻缓；避免溶液的过多转移，特别是用小口径吸管的过多转移；避免高温。 ② 细胞内源DNA酶：细胞内含活性很高的DNA酶,细胞破碎后便可与DNA接触并使其降解。 对策：为避免或纯化DNA酶活性，在DNA提取液中常选择加入EDTA、SDS、CTAB及蛋白酶等。EDTA能整合Ca2+ 、Mg2+，而Ca2+ 、Mg2+是DNA酶的辅因子。SDS和CTAB能使蛋白质变性（DNA酶也是蛋白质），蛋白酶可降解蛋白质。 ③化学因素：在过酸的溶液条件下，DNA分子可脱嘌呤，DNA分子极易在碱基脱落处断裂降解。 对策：避免DNA按触过酸溶液。 2.2.2.造成DNA污染的主要因素及对策 ①蛋白质:体内DNA常与蛋白质结合,蛋白质的污染会影响到后续的DNA操作。 对策：苯酚、氯仿抽提可使蛋白质变性而DNA不受影响。 ②RNA：污染后果依DNA的用途而异。对有些DNA实验，RNA的污染可能无关大局，而对有些实验则至关重要。 对策：RNA本身极易降解，如有必要去除则可用无DNA酶活性的RNase A（DNase-free RNaseA）处理。 三、实验条件： 1. 材料 （1）取植物嫩叶，去其叶梗及大的叶脉，用清水清洗干净，去掉表面污物，然后自然晾干或用纱布、卫生纸吸干表面残留的水分，切莫让叶片组织失水萎焉，迅速用于实验。如不能及时用于实验，可将其切碎、称重、标记，盛于干净的塑料袋内，置低于-20℃冰箱中冰冻保存，待用。 （2）吸头 1000μL 110 （3）吸头 200μL 110 （3）吸头 20μL 1000 （4）吸水纸 5卷 （5）一次性手套 50双 （6）口罩 110个 2.仪器 （1）离心机 （2）水浴锅 （3）冰箱与冰柜 （4）小三角瓶 （5）研钵 （6）振荡器 （7）微量移液器 3. 试剂 (1)研磨缓冲液：每升含氯化钠26.2989,柠檬酸三钠13.2509,EDTA37·2305,pH7.0；10mL (2) SDS溶液；0.1g (3) 氯仿-异戊醇混合液(24:1,v/v)；20mL (4) 5 mol/L NaCl；2.5mL (5) 95%乙醇；50mL (6) 10×SSC溶液：87.70g/LNaCl,44.10g/L柠檬酸三钠，pH7.0； (7) 0.l×SSC溶液：10×SSC溶液稀释100倍。 四、实验步骤： 1、称取10g植物材料,加入等量(w/v,g/ml)研磨缓冲液，再加入1%十二烷基硫酸钠(SDS),少量石英砂,研钵中研磨10min； 2、研磨浆状物加入等体积(V/v)的氯仿-异戊醇混