3基因工程在环境污染治理中的应用详解.pptVIP

*/56 原核生物目的基因的获得 基因库的构建：将总DNA酶解获得包含所有基因的DNA片段集，将每一个片段与载体连接并分别导入受体细胞，可得到所有的包含该生物体全套基因的库 */56 基因文库的筛选 通过免疫反应筛选 通过DNA分子杂交筛选 */56 真核生物目的基因的获得 cDNA文库的建立：细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和 基因组DNA文库及cDNA文库组建图 */56 DNA的化学合成：把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5’端，与细胞中DNA分子合成的方向相反；目前常用的是磷酰胺法 PCR法：体外通过酶促反应快速扩增特异DNA片段 有与被分离的目的基因两条链各一端序列互补的DNA引物 具有热稳定性的酶 dNTP作为底物 有作为模板的目的DNA序列 */56 目的基因的转移 重组DNA进入受体的过程叫转化，得到重组DNA的细胞叫受体细胞 选择合适的受体细胞：转化效率高、稳定传代、易筛选、外源基因可高效表达和稳定积累；原核生物如大肠杆菌，真核细胞如酵母菌和枯草芽孢杆菌 选择合适的载体：具有强启动子、便于连接、适合受体细胞 选择合适的导入方法：氯化钙导入法、电穿孔法、噬菌体导入法、其他方法 */56 重组体的筛选 传统生物学方法 遗传学方法：抗性筛选——插入失活检测，直接筛选；营养缺陷互补筛选——蓝白筛选 免疫学方法：有目的蛋白的抗体 利用噬菌斑筛选 核酸杂交法：利用放射性同位素标记的DNA或RNA作探针进行核酸杂交，进行重组体的筛选与鉴定 原位杂交 点杂交 Southern杂交（印迹技术） */56 利用抗生素抗性基因筛选重组体 */56 原位菌落杂交筛选 */56 Southern杂交原理 */56 DNA序列分析 Maxam-Gilbert化学降解法 用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链，通过凝胶电泳分离不同长度的寡核苷酸，对照四组不同反应所产生的电泳带的位置，读出序列 一轮反应只能测定约250bp的序列 Sanger双脱氧法（酶法） 加入双脱氧核苷酸后，DNA链的合成终止，将随机终止的和全合成的DNA链进行电泳分离，可确定碱基的分布 确定A、G、C、T四种碱基的全部序列 光学检测，适用于自动测序 */56 Maxam-Gilbert法测序原理及G反应 */56 双脱氧核苷酸的结构及其终止DNA合成 */56 Sanger双脱氧测序法 */56 2 基因工程在环境污染治理中的应用 合成有机化合物难于生物降解或降解缓慢 基因工程通过改变细胞内的关键酶或酶系统，可以 提高微生物的降解速率 拓宽底物的专一性范围 维持低浓度下的代谢活性 形成降解有毒污染物的新型催化活性 改善微生物的生物学特性 */56 形成降解有毒污染物的新型催化活性 */56 改善微生物的生物学特性 */56 微生物基因改造的主要目标及手段 设计复合代谢途径 代谢工程，利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，进而完成细胞特性改造 利用对不同底物具有降解活性的酶的组合构建新的复合代谢途径，已应用于卤代芳烃、烷基苯乙酸等的降解 通过引入编码新酶的活性基因，或对现有的基因物质进行改造、重组，构建新的微生物，可用于氯代芳烃混合物的降解 某假单胞菌可利用TNT（2,4,6-三硝基甲苯）为唯一氮源，但不能进一步降解其代谢产物甲苯、氨基甲苯和硝基甲苯；将具有甲苯完整降解途径的质粒导入微生物，并对其进一步修饰消除其硝酸盐还原反应，使得TNT可以完全降解 */56 拓宽氧化酶的专一性 将两种双氧合酶不同组分的编码基因混合，构建复合酶体系，使其实现对联苯和甲苯的同时降解 杂合多组分双氧合酶还可实现对三氯乙烯的降解 综合不同来源的联苯双氧合酶的优势，可以实现对多氯联苯的广谱、高效降解 甲苯-联苯双氧复合酶的复合组成 */56 基因工程微生物的应用——增强无机磷的去除 磷是水体富营养化的重要因素，活性污泥法只能去除城市废水中20-40%的无机磷 大肠杆菌中控制磷积累和聚磷酸盐形成的磷酸盐专一输运系统和polyP激酶由pst操纵子编码 通过对polyP激酶编码基因ppk和用于再生ATP的乙酸激酶编码基因ack A进行基因扩增，可以有效提高菌体对无机磷的去除能力 */56 */56 基因工程微生物的应用——苯及烷基取代苯的降解 甲苯降解酶具有广泛的底物范围，但无法利用苯 克隆编码甲苯还原酶的基因todC1C2BA，并将重组质粒导入P. putida mt-2中，可以彻底降解苯/甲苯/二甲苯 甲苯的降解途径 */56 基因工程微生物的应用——苯酚类污染物的降解 4-壬基苯酚的中