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2013-2014学年生命科学综合大实验 GFP分离与纯化 1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria 中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。 实验器材 2.1实验材料： 含GFP融合质粒，Top10菌株 2.2实验试剂： 质粒提取：溶液Ⅰ：50mM 葡萄糖/10mM EDTA /25mM  HYPERLINK /search?word=Tris-HClfr=qb_search_expie=utf8 \t _blank Tris-HCl，pH=8.0；溶液Ⅱ：0.2M NaOH/1% SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸钾/2M 醋酸；无水乙醇，75%乙醇，TE Buffer； 转化：0.1M预冷 CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖； GFP提取：液氮，Lysis Buffer，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶； 疏水作用层析柱材：苯基琼脂糖凝胶CL-4B； 离子交换柱层析柱材：DEAE+纤维素， Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）) Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0) SDS电泳：PEG10000，Loading Buffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等 2.3实验仪器 高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS电泳装置。 实验方法 3.1质粒提取 1.取1.5mL菌液，12000rpm离心1min，弃上清液； 2.加100μL溶液Ⅰ，充分悬浮； 3.加200μL溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min； 4.加150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min； 5.12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5ml EP管中； 6.加800μL无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心8min，弃上清； 7.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清； 8.在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）； 9.加40μL TE Buffer溶解DNA，4℃备用。 3.2感受态细胞的制备以及转化 1.取1.5mL Top10菌液，在4℃ 4000rpm离心10min，弃上清； 2.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），冰浴15min后4℃ 4000rpm离心10min，弃上清； 3.加200μL 预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4℃备用； 4.将1μL质粒和感受态细胞混合，冰浴30min； 5.42℃热激90s； 6.立即放在冰上3-5min； 7.加入800μL LB液体培养基，37℃ 150rpm培养60min（使Top10恢复正常生长）； 8.取200μL菌液涂布在LB（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上，37℃培养过夜。 3.3扩大培养 1.取含GFP质粒的Top10平板并挑取单克隆（在紫外灯照射下有绿色荧光的菌落）； 2.将挑