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生物化学实验讲义 2009年5月实验一 糖的颜色反应和还原反应 1．糖的颜色反应 [实验目的及要求] 1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法3. 掌握杜式(Tollen)试验鉴定糖的原理和方法[实验原理] 1．莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。 2．塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。 3．杜式试验：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。 [实验仪器及用品] 仪器：水浴锅器皿：吸管、试管实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。 [实验试剂] 莫式试剂：а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。 塞式试剂：间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：VHCl=2:1），现用现配。 杜式试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml,缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml。临用时配制。 [实验内容及步骤] 一、莫式实验 于4支试管中，分别加入1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1 ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5 ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。 二、塞式试验 于4支试管中，分别加入0.5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。 三、杜式试验 于3支试管中加入杜式试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。 四、实验现象记录 仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间。 [实验目的及要求] 掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。 [实验原理] 费林(Fehling)试剂和本尼迪(Benedict)试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。 [实验仪器及用品] 实验仪器：水浴锅 实验器皿：吸管、试管 实验试剂：硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。 [实验试剂] 1 费林试剂 试剂A：CuSO4·5H2O 34.5 g,溶于蒸馏水并稀释至500 ml。 试剂B：氢氧化钠125 g，酒石酸钾钠137 g，溶于蒸馏水并稀释至500 ml。 临用时将试剂A与试剂B等体积混合。 2 本尼迪试剂：柠檬酸钠（Na3C6H3O7·11H2O）及50 g无水碳酸钠，溶于400 ml蒸馏水中。另溶解8.5 g硫酸铜于50 ml热水中。将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。 [实验内容及步骤] 于3支试管中加入费林试剂A和B各1 ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。 另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1 ml，然后每支试管加本尼迪试剂2 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。  一、目的 通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，练习比色定糖法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。 二、原理 在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，520nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。 三、试剂 1． 1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 2．3,5-二硝基水杨酸试剂：甲试剂为6.9g结晶酚溶于15.2ml10%NaOH溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。乙试剂为255g酒石酸钾钠溶于300ml10%NaOH溶液中，再加入880ml