生物化学实验指导_new教程.doc

生物化学实验指导 李峰 李荣 张建平 编 湖南文理学院生命科学系 前 言 生物化学实验是以生物为研究对象，利用生物化学的原理和方法，阐明生物体内化学分子的结构与化学反应的机理，从分子水平探讨生命现象的本质，并为人类服务的一门实验科学，是生物科学、农学、动物科学专业、生命学科相关专业本科生及与湖南省中学生物学教师及科技人员重要的专业基础技术。它是在植物生物学、动物生物学、微生物学等普通生物学实验有比较全面了解及一定基础训练基础上开设的实验技术。旨在培养具有现代生物学知识，掌握现代生物化学技术的创新人才培养具有现代生物学知识前沿、掌握现代生物学基本技术，具有综合设计、创新实验能力的创新人才。 《生物化学实验指导》是熊大胜教授主持的“生物学基础实验‘531’课程体系研究”的实验教材之一。生物化学实验模块按生物化学及生化大实验的实验功能构建，承担《生物化学实验》及《生物化学与分子生物学大实验》。生物化学实验模块以提高学生应用生物化学原理和方法，解决生产实践中的实际问题为目标，改革以往生物化学实验教学大纲，从加强基础的观点出发，侧重于学生基本技能，综合能力，创新能力三个层次的培养，同时也注意增加一些新近发展起来的重要的生物化学研究方法和技术。 生物化学实验模块共包括15个实验。实验注重加强学生基本技能的培养，使学生掌握蛋白质和核酸的基本结构及组分鉴定方法；掌握蛋白质性质的综合测定，了解蛋白质沉淀和变性等重要概念；掌握最常用的蛋白质制备、分离和纯化过程和方法；通过淀粉酶的提取，活性测定以及淀粉酶动力学分析实验，加深对酶的特性认识；进一步熟悉掌握微量滴定法的基本操作技术；注重培养学生综合能力，通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作，掌握氨基酸含量的测定方法；掌握核酸的提取过程以及核酸含量和纯度的测定技术；熟悉掌握电泳技术的基本原理和操作技术；血糖的定量测定和脂肪酸的β－氧化实验，掌握有关物质代谢中生理生化指标的测定方法；在生化大实验中开设了《总RNA的提取及鉴定和半定量RT-PCR检测基因的表达差异两个综合性大实验使学生更好的将基础知识与专业技术Donnan 平衡β－氧化……………………………………（57） 实验十 DNA的琼脂糖凝胶电泳………………………………（60） 实验十一 蛋白质的透析………………………………………（62） 实验十二 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳——血清蛋白的分离 ……（64） 实验 总RNA的提取及鉴定实验半定量RT-PCR检测基因的表达差异实验 第一篇 常用生物化学实验技术及原理 第一章 透析 透析是利用小分子能通过,而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。通常的做法是将小分子和大分子的混合物放进用半透膜制成的透析袋里并沉没在大量的水中。袋内的小分子就不断通过膜进入外部溶剂中待达到平衡为止。如果对流水透析或不断更换透析袋的溶剂可以做到袋内的混合物几乎不含小分子。透析的速度受一些因素的影响。下面就粗略地讨论这些因素。 一、膜 1、材料 火棉胶是最常用的透析袋材料。各种规格的火棉胶袋已做成商品出售。也可用玻璃纸代替火棉胶。 2、制备 先将一适当大小和长度的透析管放在碱性EDTA溶液中沸腾30分钟以避免待透析的分子损失活性。然后，用蒸馏水洗涤透析管。结扎管的一端并将所研究的材料充满透析管（袋），然后结扎顶部。透析最好在新制备的管中进行，因为湿的透析袋非常容易受微生物感染。如果必须保存透析袋，则应有溶液中加入痕量的苯甲酸。 3、通透性 透析袋的通透性因袋的大小和预处理的方法不同而异。但透析过夜时，半透膜大体可以允许相对分子质量（Mr）30000以下的化合物通过。实际上没有严格的界限，透析时间延长时稍大的分子也透过膜。有一系列的商品材料有更高的透析速度和更精细的通透范围可做精细分离之用。 二、溶剂 1、水溶液 一般说，透析的速度在蒸馏水中最大，虽然通常需要特定的pH和离子强度的水溶液来稳定所研究的分子。 2、大分子溶液 透析时水将进入透析袋，因此应该将透析袋装满以避免透析的材料过于稀释。如果用一种不活泼的高分子化合物如聚乙烯醇6000代替通常使用的水溶液作为溶剂，则透析时水就会由透析袋中渗出，用这种方法透析过夜，可将200mL溶液浓缩至几mL。 三、物理条件 1、温度 透析速度也受温度的影响，温度越高透析速度越快。提高温度时，溶剂的粘度降低而扩散速度增加。此外，许多大分子对温度很敏感，因此蛋白质等的透析通常在低温条件下进行。 2、压力 大分子和小分子的分离也受通过膜时的压力梯度影响。可将透析袋放在真空中（而不放在溶液中），并敞开透析袋的一端，此时水和小分子会渗出透析袋形成超滤液，而留在透析袋中的大分子被浓缩。这个过程称为超滤。 四、董南（Donnan）膜平衡 由于大分子电解质的