苯酚降解菌分离.pptVIP

湖水污泥微生物中苯酚降解菌的分离与特性测定 实验意义 苯酚是染料、农药、医药等行业的重要生产原料和中间体,是工业废水中的常见污染物之一。由于它具有较强的生物毒性,许多国家已将其列入重点污染物名单之中,并且采取各种措施来消除环境中的苯酚污染。而且它的水体污染很难去除。 所以在这些措施中,生物修复是一种低成本的环境友好型污染消除方式,它的关键是获得具有苯酚降解功能的微生物。 实验目的 掌握从土壤中分离苯酚降解菌的方法 掌握梯度平板法分离纯化细菌的方法 掌握革兰染色的方法 实验原理 取湖水污泥，在黑暗环境下的细菌富集，将细菌在不断增加苯酚浓度的培养液中培养，得到苯酚耐受菌或者降解菌。 分离出细菌，在苯酚培养液中培养进行4-氨基安替比林分光光度法测定，比较苯酚的前后含量确定其是不是降解菌。 特性测定本实验只做革兰染色 具体细菌种属的鉴定通过核酸进行 实验材料 1、耐酚培养基 ( g/L ) :酵母膏5.00g,蛋白胨10.00g,NaCl10.00g，蒸馏水1L，PH7.0 琼脂16g，121℃灭菌20min。 2、苯酚无机盐培养( PMM,g/L ) :NH3 NO3 1.00,KH2 PO4 1.50,K HPO4 0.50,NaCl0.50,MgSO4 7H2O 0.10,pH7.0～7.2,苯酚作为碳源,浓度根据需要添加,固体培养基加2.0%的琼脂. 实验材料 3、苯酚培养液：苯酚25-75mg，尿素0.1g，微量元素10ml，蒸馏水90ml，PH7.0-7.2，121℃灭菌20min。 4、革兰染色所需试剂 结晶紫、碘液、95%乙醇、复红、香柏油 PH计，温度计，黑布，接种环，酒精灯，显微镜 实验方法 一、细菌的富集和分离 1、从校园小河污泥中取污泥，称取5.00g加到50ml含有25mg/L苯酚的PMM培养基中。 2、于30℃,.220r/min摇床5d培养后，分别添加3次苯酚无机培养液。 隔3天后第一次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至100mg/l；隔3天后第二次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至200mg/l；第三次隔3天后，添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至300mg/l 。 3、最后取培养液进行系列稀释后涂布于苯酚浓度为300mg/L的PMM固体培养基平板上，30℃培养3d后挑取形态上有差异的单菌落,。 以上所有培养均用黑布遮盖。 实验方法 2降酚菌的分离纯化： 1、梯度平板法 ①制备梯度平板：12ml不含苯酚的无菌耐酚培养基倾斜于一直径9cm的培养皿中，立即将此培养基协防形成斜面，并刚好遮住底。待凝固后，平放，再加入12ml含苯酚固体培养，完全遮住下层。 ②稀释涂布分离： 样品液稀释：将富集的培养基做10倍系列稀释（至10^-3） 实验方法 样品涂液步平板：用无菌1ml移液管分别吸取上述10^-3、10^-2、10^-1和原液依次滴加于相应的平板上，并用无菌涂布棒从平板中央均匀向四周涂布。 细菌培养：30℃恒温箱培养2天 降酚菌的纯化：用无菌接种环挑取高浓度区的菌落接种到PMM培养基上，30℃恒温培养3天 实验方法 3.最优降解苯酚细菌鉴定 革兰染色显微镜下观察 用接种针挑取少许幼龄培养物，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，风干固定。 用结晶紫的混合液染色1-2min后，用水洗。 碘液作用1min，水洗，吸干。 用95%的乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色(约30s)。 用复红液复染约2-3min，水洗，风干，用油镜观察。 注意事项 1实验人员必须较为清晰的明白实验方法后才可进行实验 2取污泥最好在水流缓的地方，污泥位置稍微深一点的，细菌才多，机会才打 3用到苯酚时，使用手套、口罩防止中毒。 预期结果 经过几天培养后培养液变浑浊 在涂布分离中能观察到单细胞菌落 革兰染色可能为红色也可能为蓝色 本实验的困难 实验技术不成熟，甚至不会，可能实验结果没有是由于实验技术的原因，所以组员要自己课下学习。 实验的未知性：目前分离的苯酚降解菌都是在苯酚污染的环境中的分离出来的，学校湖中的污泥不确定是否会分离出目的菌。 苯酚的毒性 Thanks 苯酚 苯酚能够凝固蛋白质，具有杀菌效力，来苏儿消毒药水就是苯酚和甲苯酚的肥皂液，用做消毒剂、杀虫剂等。在生产过程中如果不注意防护或由于各种事故，苯酚可造成人体急性中毒。 * * *