Talen技术及诱导多功能干细胞(iPS)在医学领域的发展应用.pptVIP

基因打靶及ES/IPS领航者 订购：021order@ 市场部：021market@ 技术支持：021service@ G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。 * * * 设置不转染同时加药的阴性对照，如果加药后阴性对照全部死亡，并且2-3天后撤去药物正常继续培养时没有重新长起来，则才能说筛出来的细胞是阳性转染成功的。 * Yamanaka 用四因子诱导ips产生，John Gurdon 进行核移植 * 脊髓性肌萎缩SMA 活运动神经元SMN1 病人会肌肉萎缩，瘫痪，幼年死亡 * Alpha-1 antitrypsin 抗胰蛋白酶(AAT) deficiency 肝脏疾病 可进一步导致肝硬化和肝癌 * 大脑和脊髓的细胞一般是不会再生的，所以过度的损害可能是毁灭性的，不可逆转的。神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致， 随着时间的推移而恶化，以导致功能障碍。 神经退行性疾按表型分为两组： * 一类影响运动，如小脑性共济失调； * 一类影响记忆以及相关的痴呆症。 * 多巴胺能神经元的变性死亡 * 脊髓性肌萎缩SMA 活运动神经元SMN1 病人会肌肉萎缩，瘫痪，幼年死亡 * * ` * 最终挑选出阳性单细胞克隆，扩增，保存，稳定遗传系建立成功 消化细胞呈单细胞，接种于96孔板中，待单细胞克隆长大后，同上进行鉴定 部分单细胞克隆测序结果： 单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系。 根据打靶效率，挑取一定数量单克隆进行测序。 续上 根据测序峰图，鉴定出双拷贝敲除的单克隆 打靶效率经验参考 建立knock-out细胞系（双拷贝敲除）： 293T，hela细胞：建系成功率100%，目前成功建系19个，打靶效率约为30 % -70%，最短耗时2个月 ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前成功建系7个，打靶效率约为20 % -50%，最短耗时4个月 数据统计至2013.07月 打靶效率经验参考 建立knock-in细胞系（单拷贝敲入） ： 293T、hela细胞等：建系成功率100%，目前已成功建系6个，打靶效率约为20 % -55%，最短耗时3个月 ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前已成功建系2个，最短耗时5.5个月，打靶效率约为10 % -28% 数据统计至2013.07月 应用实例2 动物模型——斑马鱼 Zebrafish-gene A WT TALEN 580bp Zebrafish-geneA (Kpn I) WT TALEN 580bp 401bp 179bp Genomic PCR Restrictive enzyme digest 斑马鱼内XX基因敲除 结果反馈 我方设计TALEN识别序列； 提供最终的TALEN质粒 TALEN质粒线性化； 体外转录 显微注射一细胞期受精卵 48h后收集，抽提10-15个胚胎的基因组DNA，混合 PCR扩增，酶切看结果 打靶效率为80%以上 应用实例3 动物模型——小鼠 设计构建TALEN打靶载体 细胞水平TALEN活性检测 体外转录生成mRNA 往受精卵注射mRNA 嵌合体小鼠（F0） F1 heterozygote F2 homozygote 应用实例3 动物模型——小鼠 leptinR Founders identification by T7E1 mismatch sensitive assays sequences of TALEN-induced mutations in leptinR locus in different strains 应用实例3 动物模型——小鼠 Leptin Receptor TALENed F0 founder WT littermate C57BL6 strain FVB strain Leptin Receptor TALENed F0 founder WT littermate 斯丹赛部分成功案例 北京大学 ???张老师成功建立人ES细胞某基因敲除系 北京大学?尹老师成功建立人结肠癌细胞某基因敲除系 长征医院 周老师成功建立乳腺癌细胞某基因敲入细胞系 清华大学? ? 罗老师成功建立小鼠ES细胞某基因敲入系 中国科学院生物物理研究所 范老师成功建立小鼠MEF细胞某基因敲除系 中国科学院上海生化所? 宋老师利用培训班拿到的平板直接建立仓鼠细胞某基因敲除系； 细胞建系成功案例 斯丹赛部分成