分子生物学实验2014年要点.docVIP

微量移液器的使用方法 质粒DNA (pBlueScriptII（SK）)的碱法提取 大肠杆菌总DNA的抽提 质粒和总DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 重组片段的回收 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 重组片段的连接和转化 蓝色白色菌落法筛选重组子及重组比例的计算 PCR(设计实验) 分子生物学实验计划 第一部分实验：熟悉实验室环境 实验一 微量移液器的使用方法 第二部分实验：蓝色白色菌落筛选重组子 实验二 质粒DNA (pBlueScriptII（SK）)的碱法提取 实验三 大肠杆菌总DNA的抽提 实验四 质粒和总DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 实验五 重组片段的回收 实验六 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 实验七 重组片段的连接和转化 实验八 蓝色白色菌落法筛选重组子及重组比例的计算 第三部分实验：设计实验 实验九 PCR 第一部分实验： 熟悉实验室环境 实验一 微量移液器的使用方法 实验原理：　微量移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的精密取液装置（俗称枪），基本原理是依靠装置内活塞的上下移动，气活塞的移动距离是由调节轮控制螺杆结构实现的，推动按钮带动推动杆使活塞向下移动，排除活塞腔内的气体。松手后，活塞在复位弹簧的作用下恢复原位，从而完成一次吸液过程。 1、设定好移液器的读数（1μl，5μl，10μl），按到第一档，垂直进入液面几 2、缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少 3、将液体缓慢点在做好标记的滤纸片上，先按到第一档，稍微停顿1 s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。 P10???? 0.5 ~ 10； P20???? 2 ~ 20； P100??? 20 ~ 100； P200??? 50 ~ 200； P1000?? 200 ~ 1,000； P5000?? 1,000 ~ 5,000。 图1： 微量移液器的使用方法 思考题： 要取265μl dH2O，请问如何选择移液器？ 第二部分实验 蓝色白色菌落筛选重组子 图2：第二部分实验总设计图 实验二 质粒(pBlueScriptII SK) DNA的碱法提取 实验目的： 掌握质粒小量碱法抽提的基本原理和基本步骤。 实验原理： 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 8、加25μl TE缓冲液（其中含有20μg/ml的胰RNA酶），充分溶解DNA。样品放入-20°C冰箱保存待用。 附1.各溶液的配方： 溶液I50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸 制备DNA的是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程SDS和蛋白酶K消化蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。细菌基因组DNA通常是个很大的环状DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。 9.将干燥好的DNA样品溶于25μl的TE。 思考题： 1.用本方法抽提的总DNA是否是完整的E.coli基因组，为什么？ 实验四 质粒和总DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 实验目的： 掌握DNA酶切方法和琼脂糖凝胶电泳的原理和操作要点。 实验原理： 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。G ↓