实验植物染色体组型分析.doc

实验 植物染色体组型分析 一、实验目的 三、实验材料 、实验用具 8—羟基喹啉、醋酸洋红（或醋酸地衣红）、盐酸法莫氏固定液等。 实验洋葱根尖的培养 细胞分裂时由于纺锤体的牵引及染色体不一定都缩到最短，故在制片时染色体易相互缠绕、重叠，所以，材料在固定前必须经理化因素预先处理，目的是改变细胞质粘度，破坏或抑制纺锤体的形成，使染色体缩短，并促使染色体分散等。常用的药物浓度，处理如下：0.04%—0.2%秋水仙碱水溶液处理2—5小时，a—溴代萘饱和水溶液处理0.5—4小时；对二氯苯饱和水溶液处理2—4小时；0.002M—0.2M 8羟基喹啉2—4小时，上述处理在室温下即可，若低温处理则用蒸馏水在1—4度下处理24小时。 这些药物对植物细胞都有不同程度的毒害作用，高温或长时间的处理，往往会产生多倍体或使染色体发生粘结、聚缩和解体现象，因此处理时间一般以4小时以内为适宜，温度以10—16度效果较好。 本实验：用0.002 mol／L的8-羟基喹啉20℃条件下避光处理4 h，或者0.7mM的环己酰胺中室温处理8h，将处理液吸出，然后用蒸馏水漂洗。 固定 目的是将细胞迅速杀死，并使染色体的结构尽可能保持不变和便于染色。常用的固定液为法曼氏固定液，即用95%酒精：醋酸=3：1固定1—2小时，在固定前经预处理的材料，水洗几次后可固定，必要时，可放入低温冰箱中保存，也可换至70%酒精中保存。 本实验：用卡诺液(乙醇：乙酸=3：1)4℃固定24 h以上，蒸馏水漂洗。 离解 根类分生组织的细胞必须经分离和软化后方可压片，常用的试剂是盐酸，把固定过的材料装入盛有1N盐酸的小瓶中在60度下离解10—20分钟，最高不超过30分钟。 1N盐酸是用蒸馏水将比重为1.18的盐酸82.5ml稀释至1升时即为1N盐酸（克当量溶液），也可用等量的95%酒精和浓盐酸达到离解目的。处理时间同上。 本实验：用2％(w／v)纤维素酶和2％(w／v)果胶酶的混合液37℃酶解40～90min。 染色 在洁净的载玻片上，滴上一滴醋酸洋红或醋酸地衣红溶液，而后把选定的材料（长1—2毫米的根尖）放在滴液内染色，盖上盖玻片。 染液（醋酸洋红）的配制：冰醋酸45毫升，蒸馏水55毫升加热煮沸，加2克洋红继煮，使溶液达到饱和状态，在煮沸1—5分钟，并悬入一个生锈的小铁钉至染色体液中，约1分钟后取出，冷却过滤即可，醋酸地衣红配法相同，不必加铁质。 压片 盖上盖玻片后用数层吸水纸放在盖玻片上面，用左手手指按住，然后右手用解剖针柄或细玻璃棒对准根尖所在位置轻轻敲击数下，移去吸水纸，将片子对光观看，成为均匀一薄层即可进行镜检。 组型分析 根据实验要求，对所获得染色体制片要进行细致地观察研究：比如要测定一个物种的染色体组型，必须要在相当数量的个体上取材制片，以选择足够多的，分散良好的染色体图象，体细胞的有丝分裂中期的染色体比较稳定，粗短、清晰，是通常观察、计数的适宜时期。 要识别某一物种的染色体，需要对细胞中的染色体进行计数以及一些测量与计算，首先选择10—40个染色体收缩适度、染色体均较平直、清晰的细胞，进行显微照相及测量，需测量项目计有： （1）数染色体数目 （2）染色体的绝对长度：测量每一染色体从一端至另一端的长度，因染色体的绝对长度随细胞分裂时期的不同其长度有所不同。同时因预处理作用时间长短对其长度也有影响，故染色体的绝对长度变化较大，其数据只有相对意义，而无绝对意义。 （3）染色体的相对长度：每一染色体的绝对长度和单倍体组的总长度之比。以百分数表示，染色体的相对长度数据比较稳定。 （4）着丝点的定位 a) 长短臂比值：长臂与短臂之比，简称臂比或臂率 臂比=染色体长臂/染色体短臂 b) 着丝点指数：染色体的短臂绝对长度与染色体绝对全长之比（%）。着丝点位置一般臂比是1.0—1.7为中间着丝点（M）；1.7—3.0为近中着丝点（SM）；3.0—7.0为近端着丝点（ST）;7.0—为端着丝点（T）。 c) 臂指数（N.F值）=（中部着丝粒染色体+次中部着丝粒染色体数目）×2+（端部着丝粒染色体+次端部着丝粒染色体数）×1 （5）若有次缢痕和随体，并标明位置。 上述测量计算取平均值 若染色体均为同一着丝点类型，则一细胞内的染色体按其长短顺序配对排列，编号及分组。 实验报告 在显微镜下对已经制备好的片子进行染色体观察，并计数。 根据照片进行染色体的测量，包括染色体绝对长度、相对长度、臂比、着丝点指数以及次缢痕和随体。 绘制染色体立线图和模式图 染色体形态测量数据 编号 绝对长度 相对长度 短臂 长臂 着丝点 随体 次缢痕 类型