《细胞工程》实验指导书.docVIP

实 验 指 导 书 课 程：细胞工程 授课专业：生物工程、生物技术 主 编：徐艳 实验一 实验室的概况与培养基母液的配制 一、实验目的： 熟悉植物细胞工程实验室的基本结构、必须的基本设备及其用途与作用方法，掌握配制培养基母液的基本技能。 二、材料与用具： 1、药品：生长调节类物质、无机有机化合物 4课时 1、洗涤室：水槽、工作台、蒸馏水器等 功能：器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。 2、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等 功能：器皿的干燥；器皿及培养基的消毒。 3、试剂室：试剂柜、冰箱 功能：存放试剂及器皿。 4、准备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各种玻璃仪器、金属仪器等 功能：培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析。 5、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等 功能：无菌操作。 6、培养室：培养架、摇床等 功能：培养物的控制培养。 7、驯化移栽室：如温室、大棚等 功能：试管苗的驯化移栽。 （二）培养基母液的配制： 1、MS基本培养基母液：各成分单独称量、单独溶解后混合定容 ①大量元素母液：10倍，1L 注意：CaCl2.2H2O易与其他成分反应产生沉淀； ②微量元素母液：100倍，0.5L ③铁盐母液：100倍，0.5L 注意：两者等体积溶解后混合，且需80℃水浴1h充分螯合，等待冷却后定容； ④有机母液：100倍，0.5L 母液种类 成分 规定用量 (mg/L) 扩大倍数 称取量 (mg) 母液定容体积(ml) 配1LMS培养基吸取量(ml) 大量元素KNO3 NH4NO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 CaCl2.2H2O I 900 I 650 370 170 440 10 19000 16500 3700 1700 4400 1000 100 微量元素 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H2BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSo4.5H2O CoCl2.6H2O 22.3 8.6 6.2 83 25 0.025 0.025 100 2230 860 620 83 25 2．5 2．5 500 10 铁盐 Na2-EDTA FeSO4.7H2O 37.3 27.8 100 3730 2780 500 10 有机化合物it.B1 Vit.B6 肌醇 5 0 0.1 0.5 100 100 50 100 10 50 10000 500 10 2、激素类母液的配制： ①1mg/ml的6－BA 50ml：先用0.1mol∕L的 HCL或NaOH溶解后再加水定容； ②0.1mg/ml的NAA 50ml：先用少量0.1mol∕L的NaOH溶解后再加水定容。 注：精度要求精确到小数点后三位。 （三）培养器皿的洗涤： 1、对污染的培养器皿先进行消毒灭菌处理； 2、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时； 3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净； 4、用烘箱烘干或晾干，存放于防尘橱内备用。 五、实验相关记录：　　 1、母液制备表： 培养基成分 规定用量（mg/L）））) 2、试剂标签： 母液名称 浓缩倍数 制备培养基取用量 制备日期 制备人 激素母液名称 母液浓度 制备日期 制备人 MS大量 10× 100ml/L 2008-3-30 07园林（1）组 NAA 0.1mg/ml 2008-3-30 07园林（1）组 例： 实验二 培养基的配制与灭菌 一、实验目的： 了解培养基灭菌的原理，熟悉培养基的组成和要求，掌握固体培养基配制和灭菌的基本技能。 二、材料与用具： 1、药品：各种母液、琼脂、白糖、NaOH、PH试纸等。 2、用具：分析天平、移液管、量筒、电炉、灭菌 8课时mol/L的HCl或NaOH调整PH至规定范围； 6、将培养基分装 1、打开锅盖，加水至水位线； 2、把已装好培养基的培养瓶，连同蒸馏水及接种用具等放人锅内，装时不要过分倾斜培养基，以免弄到瓶口上或流出，且物品体积不大于锅内总体积的80%； 3、盖上锅盖，对角旋紧螺丝，接通电源加热； 4、打开安全阀和排气阀排放冷气，至大量白色蒸汽冒出时关闭加压升温，或者关闭安全阀和排气阀，当压力升至0．05MPa时，打开放气阀放气至大量白色蒸汽冒出时关闭加压等温； 5、当气压上升到1210C时，保持在121-1250C之间灭菌20min左右，停止加热； 6、由慢到快缓慢排气，当气压回0后打开锅盖，取出培养基，放于无菌空间的平台上冷凝备用。 注意：①冷空气必须充分排尽，否则灭菌不彻底，容易污染； ②灭菌时间应根据器皿体积严格控制，否则易破坏PH值及化学物质，产生有害物质且培养基不易凝固； ③灭好的培养基不要放置时间太长，最多