5土壤中分解尿素的细菌的分离与计数精要.ppt

[二]制备培养基 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。（课本P24不同生物选择不同的稀释浓度进行平板培养） 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管 。 将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。另外还需要不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，这两个做空白对照，验证培养基是否被杂菌污染。 问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 1.应在火焰旁称取土壤10g。在火焰附近将10g土样加入盛有90ml无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1ml，转移至盛有9ml生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 （三）样品的稀释涂布平板 2.按照由107--103稀释度的顺序分别取0.1ml涂布平板。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。 3.然后将培养基平板倒置于培养箱内30度培养2天。每隔24小时比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态，并作好记录。 (4.挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红指示剂的培养基的斜面中，观察能否产生颜色变化。看课本P26有关内容，了解原理和结果。） 注意：实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 例如：无鞭毛的球菌，常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则形成大而扁平、边缘呈波浪状或锯齿状的菌落。 一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间）同种微生物表现出稳定的菌落特征。 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30—300的平板进行计数（可防止因培养时间不足导致遗漏菌落的数目）。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。 ◆如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验。 （五）菌落计数 [一]无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 [二]做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品 的稀释度等。 [三]制定计划 三、操作提示 之后讲课本P22的最上面内容 讲完第1点后讲课本P22中间楷体字内容引出2、3、4、内容 讲完后讲P23楷体字部分 讲完后讲P23楷体字部分 必修一有关酶的一节中，我们曾经提到过美国的科学家萨姆纳，在1926年的一天他收获了什么让他无比高兴呢？ 1926年萨姆纳从刀豆的种子中提取出来脲酶的结晶，并通过的化学实验证实了脲酶是一种蛋白质。 你知道脲酶的作用吗？土壤中的细菌也含有这种酶。 课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌能利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一.研究思路 ㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照 1、实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 PCR技术：DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 ㈠.筛选菌株 Taq细菌 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；