7重组体克隆的筛选和鉴定精要.ppt

蛋白质印迹(western blot)，又称免疫印迹(immunoblotting) 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。 Western Blot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。Western Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 一、无细胞翻译系统 第六节 转译筛选法 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。 借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 二、转译筛选 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的 甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 比较放射性