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水痘带状疱疹病毒流行的主要基因型 　　【摘要】 目的：探讨分析水痘带状疱疹病毒流行的主要基因型。方法：选取笔者所在医院2013年4月-2015年4月收集的88例水痘带状孢疹病毒标本，采用冻融、煮沸的方式提取标本中的DNA，分别检测VZV、IgM抗体，多重PCR扩增水痘带状疱疹病毒ORF22、38、54并测序。分析核酸序列可采用和Primer premier 5软件酶切位点和用Clustal W软件。结果：经多重RCP检测结果得知，水痘带状疱疹毒患者皮损标本阳性率为84.09%（74/88），同时和与Dumas序加以对比后得知，在37902、38055、38081、38177时74份阳性桥本ORF22会存有在点突变，和符合基因型J型特点相符。ORF54和ORF38分别位于PstI和Bglt酶切位点。结论：本文所研究的88例水痘带状孢疹病毒标本的主要基因型成J型、ORF54及ORF38。 中国论文网 /6/view-7165107.htm 　　【关键词】 水痘； 带状疱疹病毒； 基因型 　　中图分类号 R511.5 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2015）25-0143-02 　　doi：10.14033/ki.cfmr.2015.25.069 　　水痘会经潜伏再感染后形成带状疱疹病毒，该病毒基因组相对保守，病毒株间的差异小于0.2%，分别在整个基因组的点突变会构成水痘带状疱疹病毒的基因型基础。水痘带状疱疹病毒的基因型主要有M、E和J，研究分析其基因型有利于为水痘防控工作提供依据[1]。对此，本文则选取部分标本为研究对象观察其主要基因型，现报告如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选取笔者所在医院2013年4月-2015年4月收集的88例水痘带状孢疹病毒标本，其标本均为水痘患者，平均病程4.7 d。74例阳性患者中，54例带状孢疹，其中男31例，女23例，年龄4～40岁。20例为水痘患者，其中男33例，女22例，年龄3～81岁。 　　1.2 方法 　　1.2.1 主要试剂 大肠埃希菌JM109感受态细胞、DNA提取试剂盒、质粒pMD 19-T、TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司）；ELISA 试剂盒（德国维润（塞润）试剂公司）、2%琼脂糖凝胶（美国Promega公司）、PCR纯化试剂盒（美国Qiagen 公司）[2]。 　　1.2.2 临床标本收集 先用无菌0.9%氯化钠溶液对患者水疱、脓疱或浆痂等皮损处清洁2次，之后用无菌棉签轻轻擦拭疱液及其基底部。最后签在盛有1 ml 0.9%氯化钠溶液的离心管中充分将无菌棉签充分搅拌后。混悬液在-20 ℃条件下保存。 　　1.2.3 DNA提取 在混悬液标本5 min中放入10 000 r/min离心，舍弃上清液后；加入100μl DNA提取液涡旋混匀。在100 ℃孵育10 min后放入-20 ℃状态下冷冻1 h；10 000 r/min离心5 min，收集上清液。 　　1.2.4 PCR检测 （1）引物：根据相关文献针对水痘带状孢疹病毒ORF22、38、54的合成引物（北京奥科公司）。其中ORF22扩增产物为447 bp，上游引物为：5-GGGTITITI’GTATGAGCGTTGG-3’，下游引物为：5-CCCCCGAGGTI’CGTAATATC-3’。ORF38扩增产物为350 bp，上游引物为：5-TTGAACAATCACGAACCGTT-3’，下游引物为：5-CGGGTGAACCGTATTCTGAG-3’ORF54：扩增产物为222 bp，上游引物为：5-GGAACCCCTGCACCATI’’AAA-3’，下游引物为：5-TCCCTI”CATGCCCGTI’ACAT-3’。（2）PCR扩增反应体系和条件：在50 dl反应体系中依次加入10×反应缓冲液（含MgCI2：20 mmol/L）5.0μl，2.5 mmol/L dNTP 4.0 dl，上下游引物各0.2 dl（100μmol/L），DNA样品6μl，Taq酶0～3μl（1.5 U），去离子水34.3μl。在多重PCR时，同时加入3对引物，上下游引物各0.2μl，去离子水33.5μl，其他条件不变。PCR产物均经3%琼脂糖凝胶电泳。 　　1.2.5 序列测定与基因型判定 按照常规方法连接回收产物与质粒pMD 19-T 载体，同时采用PCR 纯化试剂盒回收聚合酶反应产物，之后转入大肠埃希菌JM109感受态细胞。初步鉴定菌落和筛选蓝白斑。如果所检测克隆菌株为阳性，则立即送往北京相关技术工作进一步测序，在GenBank 中用Blastn比较分析测序结果。相关研究文献支出，在37837～38283位点之间，水痘带状疱疹毒有6个位点可准确的将该病毒分为4个基因型，即E、J、M