PCR与DNA测序概要.ppt

引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* Oligo6 （引物评价） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3 （在线服务） 四、PCR反应特点 第二节 逆转录PCR （ reverse transcription PCR, RT-PCR）(P403 ) 三、逆转录病毒合成cDNA的基本过程 将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排列顺序。 DNA 序列测定方法： 1. Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反应。 3.自动测序法。 Sanger 电泳检测--310 电泳检测--3100 步骤１：毛细管灌胶 步骤２：样品盘移动 步骤３：电进样及电泳 步骤４：荧光激发及检测 补充：测序及连接方法的遴选 对文库中的各片段逐一测序，测序后的连接则是一个巨大的任务（生物信息学）。目前有两种思路： 1. 第一种是全基因组散弹法（whole genome shut-gun)：即从文库中随机取，然后分析，分析后再根据碱基序列进行拼接，由Celera提出。 步骤： 取全基因组DNA → 纯化酶切或超声波打断 → 电泳 → 回收DNA片段 → 构建质粒文库 → 转化宿主菌 → 扩增培养 → 提质粒DNA为模板进行PCR测序 → 上测序仪 → 处理测序数据 → 补缺 → 完整基因组序列。 shutgun法 2. 层次散弹（hierarchical shutgun） 第二种是层次散弹（hierarchical shutgun）。即把大的基因组先进行分层，如染色体编号、染色体下片段编号、小片段上作物理标记，然后再对小片段测序，这样使最后“拼接”变得容易得多。 Thank You 5′— GATCACTACTG —3 ′ 标记 5′— *GATCACTACTG —3 ′ G：DMS C：肼（加盐） G+A：甲酸 C+T：肼 5′-*GATCACTACTG 5′-*G G 5′-*GATCACTACTG 5′-*GATCACTA 5′-*GATCA 5′-*GA 5′-*G 5′-*GATCACTAC 5′-*GATCACT 5′-*GATCAC 5′-*GATC 5′-*GAT 5′-*GATCACTACT -*GATCACTACTG- 5′-*GATCACTAC 5′-*GATCAC 5′-*GATC -*GATCACTACTG- 电 泳 5′-*GATCACTACTG 5′-*GATCACTACT 5′-*GATCACTAC 5′-*GATCACTA 5′-*GATCACT 5′-*GATCAC 5′-*GATCA 5′-*GATC 5′-*GAT 5′-*GA 5′-*G C+T C G G+A 5′ 分析仪器的新发展： 377型遗传分析仪 377 型DNA 全自动测序仪采用经典的聚丙烯酰胺凝胶的电泳方式, 结合美国应用生物系统公司专利的四色荧光标记, 激光检测, 一个泳道检测的方法, 具有测序结果准确性好, 精度高, 操作简便快速等特点, 已成为全球应用最多最广泛的全自动DNA 测序仪之一。 310型全自动遗传分析仪 其他DNA全自动分析仪： ABI Prism? 3100遗传分析仪? 3700型全自动遗传分析仪 安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE 500/1000/4000 P406－407 DNA序列测定 P415-417 第二 节 分子杂交和印迹技术下下次课讲 P408-415 DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。对DNA一级结构的研究，有助于探索基因结构与功能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传信息，正是人类基因组计划（human genome project, HGP)的最主要目标之一。 DNA 测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（Sanger 法、酶促法）和化学裂解法（Maxam-Gelbert 法）。二者均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。不管是酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后，读出待测DNA的连续序列。 一、 Sanger 双脱氧链终止法 P415，Note： Figure 20-6 （一）原理(单链) DNA链中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是2`