zzj蛋白质概要.ppt

* * * * * * 缩合剂：DCC（二环己基碳二亚胺）直接接肽 * * 支持介质： 聚苯乙烯树脂 合成方向： C端 → N端。 合成程序： 右图 3、多肽的固相合成 断裂与去保护 挂接 去保护 中和 缩合 芴甲氧羰基氨基酸 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNFB法 α-氨基的一个H键可被烃基（包括环烃及其衍生物）取代 DNP-氨基酸（黄色） 2，4-二硝基氟苯（DNFB） Sanger试剂 * 苯异硫氰酸酯，PITC 苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸） ? 苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。 被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸（测序） Edman反应 PITC PTC-氨基酸 PTH-氨基酸 PITC法 p170 * N-末端分析 B.酶 法（氨肽酶法） 从多肽链的N-末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线。 亮氨酸氨肽酶：最常用 氨肽酶M：较常用 2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定 Gly-Ser-Val p170 * N-末端分析 C.常见问题及处理方法： 2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定 经常碰到N-末端残基的氨基被封闭。因此不能与Edman降解试剂发生作用。 焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。 焦谷氨酸氨肽酶 p170 * ② C-末端分析 A.肼解法 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。 Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。 2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定 p170 * ② C-末端分析 B.还原法, 硼氢化锂(LiBH4) 肽-COOH?生成肽-CH2OH?水解,分离,层析鉴定。 此法比较少用。 C.羧肽酶法，（Pro不能测） 2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定 羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a 羧肽酶B：只水解Arg、Lys Val—Ser—Gly p171 * ①.多肽链之间的连接方式 A.共价键 二硫键 -S-S- 酰胺键 -CO-NH- 酯键 -CO-O- B.非共价键 氢键 R……H 离子键 R+……R- 疏水作用 R R 范德华力 R R 3、肽链的分离、纯化与测定 p171 * ②.肽链的拆离方法 A.二硫键的拆离 过甲酸氧化法和巯基化合物（巯基乙醇）还原法。 B.非共价键的拆离 8M 尿素或6M 盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散而成无规则的构象。 C.烷基化试剂保护 如碘乙酸保护还原-SH，防止重新氧化。 3、肽链的分离、纯化与测定 * * 4、肽链的部分水解 拆链得到的多肽链一般是100-1000个氨基酸，需要将其切成小肽段，分别测定它们的顺序，最后连在一起。 1、裂解的部位要专一。 2、裂解点要少，切的肽段的大小要合适。 3、产率要高，要求试剂不能破坏裂解后的肽段。 裂解的方法：化学法，酶学法 p173 * ①、化学裂解法 A.溴化氰裂法：专一裂解Met羧基所成的肽键 4、肽链的部分水解 p174 * ①、化学裂解法 B.羟胺断裂：专一裂解Asn-Gly之间的肽键。 4、肽链的部分水解 专一不很强，Asn-Leu,Asn-Ala键也部分裂解 由于Asn-Gly出现机率较低，所以所得片断较大。 p175 * ②、酶裂解法 A.胰蛋白酶( trypsin )　 4、肽链的部分水解 B.糜蛋白酶(Chymotrypsin) D.胃蛋白酶(Pepsin) C.嗜热菌蛋白酶(Thermolysin) p173 Trypsin ：最常用的内肽酶，只断裂 R1 = 赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链。 专一性较强，水解快。 糜蛋白酶Chymotrypsin：酶的活力受PH值调控（适碱性，pH=8-9） R1=苯丙氨酸Phe, 　色氨酸Trp, 　酪氨酸Tyr; 　亮氨酸Leu　等疏水氨基酸 　蛋氨酸Met和 　组氨酸H