z第二章基因工程概要.ppt

Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 第二章 基因工程制药（8学时） 第一节概述 第二节基因工程药物生产的过程 第三节目的基因的获得 第四节基因表达 第五节基因工程菌生长代谢的特点 第六节基因工程菌的不稳定性 第七节基因工程菌中试 第八节重组工程菌的培养 第九节高密度发酵 第十节基因工程药物的分离纯化 第十一节变性蛋白的复性 第十二节基因工程药物的质量控制 第十三节基因工程药物的制造实例 第一节 概 述 利用基因工程技术生产药品的优点： （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 利用基因工程技术生产药品的优点： （4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 第二节 基因工程药物生产的过程 基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌(或细胞），内进行复制和表达的技术。 基因工程药物生产的上游和下游 上游阶段：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成； 下游阶段：是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。 基因工程药物制备的一般过程(p16) 基因工程基本过程 第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法，逆转录－聚合酶链反应法。（不能直接分离？） 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA（cDNA），然后进行 cDNA 的克隆表达。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。 逆转录法的步骤 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 cDNA克隆示意图 1、mRNA的纯化 真核细胞 mRNA 3’-polyA （20～250) 采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。 3、cDNA第二链的合成 除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链(碱解或RNaseH酶解) 然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链3’-末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链(常用Klenow酶或DNA聚合酶I) 切除发夹结构（核酸酶S1，专一性切除单链DNA） 4、cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有三类： 细菌质粒（如pBR322、 pUC等）插入片段10kb 噬菌体（如?gt10、 ?gt11等） 10kb 动植物病毒 根据重组后插入的cDNA能否经转录和翻译合成蛋白质 非表达型载体（pBR322及?gt10 ） 表达型载体（pUC及?gt11 ）有利于目的基因的筛选 5、将重组体导入宿主细胞 1）转化：指质粒DNA 或以它为载体构建的重组DNA 导入细菌的过程。 2）转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 脂质体介导： 原生质体融合： 电穿孔： 显微注射： 基因枪： 病毒介导： 6、cDNA文库的鉴定 （1）表型改变： 根据重组体的表型进行筛选，抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变） （2）结构特征： DNA大小、酶切图谱、杂交（核酸、蛋白）、PCR检测、DNA序列分析 （3）免疫化学检测：表达产物分析 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用： （1）核酸探针杂交法。 根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 （2）免疫反应鉴定法。 用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。 分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定（限制酶图谱、基因测序等）。 三、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学