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TALEN靶向基因敲除 Report ：wei Liu S1417027 什么是基因敲除? 通过某种方法将一个特定的目标基因破坏，使其失去原有的功能。 为什么要做基因敲除? 基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一。 如何证明一个基因编码一种毒力因子？ 该基因存在于毒力菌株，而不存在于无毒菌株。 当该基因被敲除时菌株毒力消失或下降。 当该基因被补回（敲除）突变菌株时毒力得到恢复。 基因敲出的方法 经典方法：自杀质粒，同源重组 革命性 ：RNAi 饱含希望与失望的技术：ZFN 新的里程碑：TALEN 怎样做基因敲除？ 怎样做基因敲除？ 解决两个问题 1.识别目的基因。 2.对目的基因进行敲出。 TALEN技术 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，识别靶点核酸序列，核酸酶发挥内切酶活性，打断目标基因，完成基因敲除的过程。 由34个aa重复序列组成一个单元，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Diresidue, RVD) 对应识别一个目标碱基。 TALEN基因敲除基本流程 确定靶点：选择目标基因外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点。 TAL靶点识别域的克隆构。 3. 将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体。 4. 将重组真核表达质粒转入（卵）细胞以表达重组 核酸酶，敲除基因。 5. 筛选突变体。 构建TAL靶点识别域 1.TAL的核酸识别单元为由34aa组成的模 块中的双连氨基酸（RVD）。 2.RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。 3.欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14 -18个）串联克隆即可。 具专利保护的克隆构建系统 步骤一：靶点识别单元串联。 步骤二：TALEN表达质粒构建。 真核表达TALEN质粒对 1.真核表达载体FokI需形成2聚体方能发挥活性。 2.在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除 突变体筛选 1.PCR产物酶切鉴定以筛选发生目标基因敲除的突变个体。 2.当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测。 怎样做TALEN？ 敲除效率 灰度扫描定量证实突变效率高于10% TALEN技术应用展望 1 靶向基因表达调控 2 靶向基因敲除- NHEJ 3 靶向基因敲入-HR 基因治疗 例如：chemokine receptor 5（CCR5）基因 Talen的其他应用 TALEN介导的同源重组 优点:同源重组发生率升高几个数量级。 欢迎提问 谢谢！
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