罗胜祥食品中葡萄球菌肠毒素的测定方法分析报告.ppt

5-4食品中葡萄球菌肠毒素的测定方法 三.反向间接血凝法 生技2班 111303216 罗胜祥 葡萄球菌及其肠毒素 葡萄球菌是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名，用革兰氏染液染色呈紫色。 根据生化反应和产生色素不同，可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌三种。其中金黄色葡萄球菌多为致病菌，致病能力也是最强，可引起化脓性病症和败血病，表皮葡萄球菌偶尔致病，腐生葡萄球菌一般不致病。 葡萄球菌肠毒素分A、B、C1、C2、C3、D、E和F八个血清型，除F外，其余均能引起食物中毒。 革兰氏染色原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。而革兰氏阴性菌？ 葡萄球菌肠毒素的测定方法 （一）动物学试验：即用幼猫和猴作为研究对象，喂食肠毒素，然后观察动物可能出现的各种异常的生理或形态变化，他是测定食物中肠毒素较早采用的一种方法 （二）血清学试验：血清学试验是把肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。主要方法有免疫琼脂扩散法、酶联免疫吸附法、反向间接血凝法、免疫荧光法、 放射免疫检测法等。 （一）反向间接血凝法（RPHA）的原理 致敏血球与被测液的相应抗原发生凝聚反应，即出现反向间接血凝现象。 间接血凝试验 间接血凝试验可分为三类： ①红细胞包被抗原，用以检测抗体的血凝反应，称为正向间接血凝反应（PHA）； ②红细胞包被抗体，用以检测抗原的血凝反应，称为反向间接血凝反应（RPHA）； ③先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合然后再加入抗原（或抗体）致敏的红细胞，则能抑制原先的血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。间接血凝抑制试验可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。 （二）试剂 （1）反向间接血凝诊断试剂盒 （2）1%致敏血球 （3）1%正常兔血清盐水 （4）0.85%生理盐水 （5）聚乙二醇 （三）设备与材料 均质器及均质杯（250ml）、离心机及离心瓶（250ml）、透析袋、血凝板（96孔）、微量加样器（25μl）、微量混合器、培养箱 （四）检验程序 （五）结果判定 （1）++++：血球呈均匀凝集，布满整个孔 （2）+++:血球大部分凝集，较（1）稍小 （3）++：血球50%凝集，边缘较松散，孔底有少量颗粒积沉 （4）+：血球在孔底沉淀面积较大，周围有散在的少量集。 （5）+/-：血球下沉至孔底，周围有较少凝集。 （6）-：血球下沉至孔底呈点状，边缘控齐。 一般“++”以上作为阳性结果 谢谢观赏 本故事纯属虚构,如有雷同,纯属巧合 * * 葡萄球菌革兰氏染色图 金黄色葡萄球菌 先将各型肠毒素抗血清通过化学试剂吸附或偶联于绵羊、鸡和人“O”红血球表面，然后再加入被检的含有相应肠毒素的标本，出现血细胞凝集即为阳性。该试验简便、快速，检出灵敏度高，可达1ng/ml，1h-3h小时即可判定结果。 反向间接血凝法的最大优点是能检出食物样品中微量肠毒素，而不需要浓缩样品浸液，可以简化其他方法不可缺少的样品前处理的繁琐程序，日本已于1982年采用RPHA法检测食品中的葡萄球菌肠毒素。 血凝试剂杯 血凝试剂盒 固体检样100g，加入0.85%NACL100ml，4°C浸泡18-24h， 用纱布过滤；液体检样直接吸取100ml，高速均质3min 4500r/min离心30min 将样液移入5ml离心管中，7000-8000r/min离心20min 吸取上清液装入透析袋，包埋与PEG中4°浓缩过夜 用3ml生理盐水分数次将透析袋内容物洗出 取上清液，加入1mol/l氢氧化钠或盐酸，调节PH为7.0 确定在同一块板上的致敏血球的型别种类，每一种类型须各有一个阳性 和阴性对照，并做好标记 每孔加25μl样液，同时在对照孔中各加25μl阳性对照物和阴性对照 物，并排除气泡 在每孔中迅速加入25μl1%的致敏血球 把血凝反应板放在微量混合器上充分混匀 取下血凝反应板，用玻璃板盖住表面置37°