四细胞融合和单克隆抗体精要.pptVIP

（2） 颗粒性（细胞）抗原（不需用佐剂）可用5×106~2×107细胞，作皮下或腹腔注射； 2~3周后重复一次；再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。为挑选免疫反应较好的动物进行融合，第二次免疫后10天左右应从尾部取血，检查抗体滴度。 常规免疫法 脾细胞的制备 (1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表； (2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次； (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可； (5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中 置5分钟； (6)离心(800一1000转／分)计数、备用。 目前最常使用的是PEG介导的细胞融合方法，具有操作简便、快速省时且融合效果好等优点。50%PEG(1000-4000），pH8.0，38℃,1min。 2、细胞融合 配制所需溶液 RPMI 1640（DMEM）培养液 完全培养液 在80 mL不完全培养液中加入56℃灭活30min的无菌胎牛血清20 mL即成，4℃保存。 无血清培养液 将1袋培养粉溶于1000mL四蒸水，磁力搅拌20～30min，过滤除菌，4℃保存。 A母液(×100) 称取1.76 mg氨基喋呤(A)，加90 mL三蒸水溶解，用约0.5mL、浓度为1 mol／L HCl中和。补加水至100mL，过滤除菌，分装，-20℃保存。 HAT选择培养液 完全培养液100mL，加HT母液1 mL和A母液1mL。用7.5% NaOH调pH至7.2～7.4即成，4℃保存。 HT母液(×100) 称取次黄嘌呤(H)136.1 mg，胸腺嘧啶核苷(T)38.8 mg，加三蒸水至100mL。在45～50℃水浴中保温1h使其溶解，过滤除菌，分装。-20℃保存。 HT培养液 完全培养液100mL，加HT母液1mL即成。4℃保存。 50％PEG 称取PEG(mw=4000)2g，放入青霉素小瓶，加胶塞并插一针头，高压蒸气灭菌15min后取出，即刻加入2mL完全培养液(其中可加 0.3mL二甲基亚砜，可提高融合率)，注意边加边摇，直至完全混合，- 4℃保存。 用时预热至37℃，配制后不可放置过久，以防变碱。 融合步骤： 取指数生长期的两亲本细胞悬液（骨髓瘤细胞约107个，脾细胞约108个）1:10混合─→离心，弃上清液，将沉淀细胞轻轻弹松─→边转动试管，边滴加 0.5~1mL 50％PEG，1分钟内加完，37℃静置融合1～2min─→加入30mL无血清培养液，稀释以终止融合─→800r/min离心8~10分钟，弃上清液─→加10mL HAT培养液（也可先用完全培养液融合培养24h后开始筛选）悬浮细胞─→取0.1mL，加到已长有饲养细胞的96孔培养板中─→37℃、5% CO2、饱和湿度下培养─→筛选。 3、杂交瘤细胞的筛选及抗体检测 杂交瘤细胞的筛选主要用HAT选择法。 (1)融合后7—10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔2—3天半量换液一次； (2)两周后可改用HT培养液培养，或仍用HAT培养液； (3)2—3周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明； (4)待集落增殖生长至1／3孔时，应进行抗体检测。 筛选原理 抗体检测 目的：把含有分泌抗体杂交瘤细胞的培养孔挑选出来。 经过两周左右的筛选生长，杂交瘤细胞基本长满培养孔的1/3~1/2，此时，吸取培养液进行抗体检查，由于仅有少数能分泌针对免疫原的特异抗体，且产量较低，因此，常用酶联免疫技术（ELISA）检测各孔培养上清液中抗体，具有阳性反应的细胞即为目的细胞。 确定分泌抗体的杂交瘤细胞后，进行扩增培养，并适时冷冻。 4.杂交细胞的克隆化 杂交细胞的克隆化是保证阳性杂交瘤细胞能处于优势生长（单独培养）、获得针对某一抗原决定簇的特异性均质抗体的有效途径。 常用方法 有限稀释法； 软琼脂培养； 单细胞显微操作法等。 一般常用有限稀释法和软琼脂法这两种方法 ，需要培养饲养层细胞以促进单个克隆细胞生长。 ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。 5.单克隆抗体的大量生产