液相色谱―线性离子阱―静电场轨道阱回旋共振组合质谱法鉴定乙胺嘧啶在大鼠体内的代谢物.docVIP

液相色谱―线性离子阱―静电场轨道阱回旋共振组合质谱法鉴定乙胺嘧啶在大鼠体内的代谢物 　　摘 要 研究乙胺嘧啶在大鼠体内的代谢方式与途径。大鼠以5 mg/kg单剂量口服乙胺嘧啶后，在不同时间点分别采集其血液、尿液和粪便样品。采用液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱回旋共振组合质谱仪（LC-LTQ-Orbitrap）检测乙胺嘧啶在大鼠体内的代谢物，结合相关代谢软件，共鉴定出10种代谢产物，主要的代谢途径包括苯环上的羟基化、N-氧化、双氧化、N-葡萄糖醛酸结合、甲基化+葡萄糖醛酸结合、羟基化+葡萄糖醛酸结合和N-氧化+葡萄糖醛酸结合。除乙胺嘧啶3-N-氧化物已经在大鼠体外代谢研究中被发现外，其余9种代谢产物均首次在大鼠体内发现。 根据其精确分子量及多级质谱的碎片特征，对这些代谢产物的化学结构做出推断，并建立乙胺嘧啶在大鼠体内的代谢谱系。研究表明，乙胺嘧啶在大鼠体内的Ⅰ相代谢方式主要是羟基化和N位氧化，Ⅱ相代谢方式主要是甲基化和葡萄糖醛酸结合。 中国论文网 /8/view-7206863.htm 　　关键词 乙胺嘧啶； 大鼠； 线性离子阱-静电场轨道阱回旋共振质谱； 代谢物 　　1 引 言 　　乙胺嘧啶（Pyrimethamine，PYR）又称2，4-二氨基-6-乙基-5-对氯苯基嘧啶，分子式为C12H13CIN4，是一种二氨基嘧啶的衍生物。二氨基嘧啶类化合物（Dia minopyrimidines）包括许多二氢叶酸还原酶抑制剂药物，除乙胺嘧啶外，还有三甲曲沙和吡曲克辛等[1]，其中以乙胺嘧啶的抗原虫活性最强。乙胺嘧啶主要作用于二氢叶酸还原酶，阻断四氢叶酸的产生，导致核酸合成减少，使得原生生物的细胞核分裂受阻，繁殖受到抑制。因此，它被普遍用于疟疾的预防和治疗，另外乙胺嘧啶与磺胺类的联用也被认为是针对人畜共患的弓形虫病最有效的治疗方式[2]。在兽医临床，乙胺嘧啶还可用于防治禽类球虫病、疟原虫病和鸡的住白细胞原虫病等。但是， 许多研究表明，乙胺嘧啶对不同动物都表现出生殖毒性或基因毒性并且有着不同程度的致畸能力[3～7]。然而，关于乙胺嘧啶在动物体内代谢研究的基础资料却非常少。 除早期少量国外文献对大鼠体外代谢研究中可见代谢物乙胺嘧啶3-N-氧化物的报道[8，9]，目前，对乙胺嘧啶在大鼠体内其它代谢方式并不明确，因此难以对乙胺嘧啶做进一步的毒性评估。 　　随着技术的成熟和发展，高分辨质谱仪越来越多地应用于药物的代谢研究[10～13]。本研究选用的分析仪器是线性离子阱-静电场轨道阱回旋共振组合质谱仪（LTQ-Orbitrap MS），其中LTQ能够获得化合物多级质谱（MSn）下的碎片离子，可提供化合物丰富的结构信息，而Orbitrap则保证了高质量精度和分辨率[14～16]，再结合药物原型成分的质谱裂解行为和相应分析软件，可快速分析鉴定出可能的代谢产物[17]。采用本方法，在大鼠的生物样品中共鉴定出10种代谢产物，并建立起乙胺嘧啶在大鼠体内可能的代谢谱系。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　液相色谱系统配置FINNAGAN SURVEYOR MS Pump Plus和Autosampler Plus（美国Thermo Fisher公司）；线性离子阱-静电场轨道阱回旋共振组合质谱仪（LTQ Orbitrap Discovery，美国Thermo Fisher公司）； Xcalibur工作站和Mass Frontier 5.0软件（美国Thermo Fisher公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore公司）；AUW120D型电子分析天平（日本岛津公司）；HS250 Basic型旋涡振荡器（马来西亚IKA公司）；N-EVAPTM11型氮气吹干仪（Organomation Asscociate公司）；HS10260D型超声仪（Benchtop公司）。 　　乙胺嘧啶（99.6%，批金坛市鑫达医药化工有限公司）； 6mL Poly-Sery MCX小柱（上海安谱科学仪器有限公司）； 甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯（美国ThermoFisher公司），其它试剂均为分析纯。 　　2.2 实验动物与样品采集 　　SD大鼠10只，雌雄各半，体重为（203.8±6.4） g，购自南方医科大学实验动物中心。PYR按5 mg/kg单剂量灌服给药。给药前12 h及给药后4 h禁食，仅提供自由饮水。给药前经眼眶静脉采集空白血样，收集空白尿液和粪便。分别在给药3， 6， 12和24 h后采集血样， 并收集6， 12， 24， 36和48 h各时间段内的全部尿液和粪便。每次采血1 mL左右，置于含肝素钠生理盐水的 1.5 mL 塑料离心管中，混匀。在4℃下，4000 r/min离心10 min制备血浆；粪便70℃下