2.2基因工程的载体与工具酶.ppt

第二节 基因工程的载体和工具酶 基因工程的载体 一 基因工程的载体 载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体DNA 1、载体的功能及特征 2、质粒 1、用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体，加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 2、加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物； 3、加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质； 4、离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质； 5、乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA； 6、用无DNase的RNase去除残余的RNA（选择）。 2、噬菌体或病毒DNA l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 。 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 。 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。 l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。 3、柯斯质粒 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。 能像质粒那样在受体细胞中自主复制。 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围。 不能体内包装，不裂解受体细胞。 二 基因工程的工具酶 限制性内切酶 DNA连接酶 其它酶类 T4噬菌体 电镜下的噬菌体 作业： 基因工程常用的载体有哪些？作为基因工程的载体，应具备什么特点？ 基因工程常用工具酶有哪些？请举例说明。 5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘ 5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’ 3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’ HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端） 限制性内切酶识别特定的碱基序列 同裂酶（isoschizomers)： 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 同尾酶（isocaudamer）： 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 2、ＤＮＡ连接酶（DNA ligase） 该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二酯键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。 * * 基因工程的工具酶 ● 载体的功能 ■ 运送外源基因高效转入受体细胞 ■ 为外源基因提供复制能力或整合能力 ■ 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 ● 载体应具备的条件 ■ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） ■ 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 ■ 具有较高的外源DNA的载装能力 ■ 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 （多克隆位点） ■ 具有合适的筛选标记 ● 质粒：是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，1kb--200kb。 ● 质粒的基本特征 ■ 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系，根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 ■ 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。 ☆ ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 以大肠杆菌的质粒为例： ■ 质粒的可转移性 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。 ☆ 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义 ■ 携带特殊的遗传标记 ● 重要的大肠杆菌质粒载体 (Boyer) pBR322： 松弛型复制 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 /