Chapter+5-4+亲和色谱和超临界流体色谱重点分析.pptVIP

应用 根据研究报道, 用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中纯化血小板第4 因子(PF4)。将单克隆抗体Sz- 95- LgG 与溴化氰活化的Spharose 4B 凝胶连接成亲和色谱柱, 人血小板破碎液经此亲和色谱柱上样后, 经洗脱获得PF4。结果表明, Sz-95- Sepharose 4B 亲和色谱柱的偶联率为72%, 每1mL血小板破碎液中可以纯化到PF4 18 μg。 基团专一性大分子亲和色谱 指用对某一类结构相近的物质有亲和性的大分子作为亲和配基偶联在色谱介质上进行的色谱技术。 蛋白A亲和色谱 伴刀豆球蛋白A亲和色谱 肝素亲和色谱 1）分离纯化大分子物质 如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose 4B 2) 研究酶的结构与功能： 分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。 亲和色谱的应用 样品 t-PA的纯化—酶的抑制剂为亲和配基 干扰素的纯化—免疫亲和色谱 脱氢酶的纯化—色素亲和色谱 淀粉酶抑制剂的纯化—固定化金属离子亲和色谱 基因重组融合蛋白的纯化 超临界流体色谱法 超临界流体色谱(Supercrical Fluid Chromatography, SFC)是以超临界流体作为流动相的色谱方法，是20世纪80年代以来发展迅速的一个色谱分支，所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。它既不是气体，也不是液体，但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。从理论上说SFC既可以分析GC法难以处理的高沸点、不挥发性样品，又有比HPLC法更高的柱效和更短的分离时间，且可使用二者常用的检测器，也可与MS、FT-IR光谱仪等在线联接，因而可以方便地进行定性、定量分析。在中药药物分析领域已有愈来愈多的应用。 一、超临界流体色谱的特点与原理Principle and character of supercritical fluid chromatography 1．超临界流体的特性 对于某些纯物质来说，具有三相点和临界点，如图所示，从图中可以看出，物质在三相点，气、液、固三态处于平衡状态，当处于临界温度和临界压力以上时，则不论施加多大压力，气体也不会液化，此时即非气体，也非液体，而是以超临界流体形式存在。 超临界流体对于分离具有极其有用的物理性质，这些性质恰好介于气体和液体之间。表对气体、液体、和超临界流体的有关物理性质进行了比较。 气体、液体、超临界流体物理性质的比较 流动相 密度（g/ml） 扩散系数（cm2/s） 粘度（g/cm.s） 气体 超临界流体 液体 约10-3 0.2-0.9 0.8-1.0 1-10-2 10-3-10-4 ＜10-5 10-4 10-4-10-3 10-2 2.原理 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC； 分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值； 压力效应： SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）； 超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小； 压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。 CO2流动相，当压力改变：7.0→9.0×106 Pa，则： C16H34的保留时间 25min → 5min。 程序升压 HPLC与SFC比较 与GC法和HPLC法比较，因超临界流体的粘度接近于气相色谱的流动相，对溶质的传质阻力小，可以使用更高的流速洗脱，因此SFC的分离速度快于HPLC而与GC相当；超临界流体的扩散率介于GC和LC之间，因而峰展宽小于在气体中。 SFC中的流动相不是惰性的传输介质，这不同于GC而与LC一样，溶质与流动相间有相互作用，利用此点可调控选择因子α 当考虑溶质分压时，也可利用SFC的两重性，即被测物质在超临界流体中的溶解性非常接近其挥发性，而发生温度却较低，因此，在一定压力下，超临界流体溶解的分子的分压比在气体中高几个数量级，这就可以实现对大分子、热不稳定性化合物、 高聚物等的有效分离。 二、超临界流体色谱仪的结构与流程 1.结构流程 2.主要部件 （1）SFC的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测