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实验三：DNA提取及PCR反应 蒋建伟 一、DNA提取的基本步骤 DNA提取 （一）样品准备： 1、组织： 3 g 组织，用8 层纱布包好，再包多层牛皮纸，浸入液氮，取出，用木锤敲碎。 碎组织放入搪瓷钵中，加少量液氮，碾磨至粉末状。 在50 ml离心管中，加10 ml DNA提取液，用玻棒边搅动液体，边加入组织粉末，37 ℃混匀。 2、组织， 3 g ，-70 ℃保存，临用时用玻璃匀浆器，用DNA提取液 将组织磨成匀浆。 注： DNA提取液 见 p-8 或 p-11,下同。 3、培养细胞 消化收集细胞，PBS洗3次，加10ml DNA提取液，混匀。 4、血液 取血液离心，取淡黄色白细胞层，加NS，离心。 或者加D2.H2O，离心，收集白细胞。 加10 ml DNA提取液，37 ℃ mix。 （二）提DNA 酚抽提法： ?加RNase，37℃1 h， 加蛋白酶K，50 ℃ ，3 h ； 或 37 ℃ 12 h , 不时mix 加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。 加等体积酚，充分mix，9000rpm， 3min，小心吸取上层粘稠水相。 氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次。9000rpm ，3min，小心吸取上层粘稠水相。 ?移到50ml烧杯中，加2.5倍体积冷无水乙醇，用玻棒钩出DNA。 TE 溶解。 2、异丙醇沉淀法： 原理： 用2倍体积异丙醇沉淀DNA溶液，DNA沉淀是丝状，而RNA溶于异丙醇中，可除去RNA。 细胞，PBS洗2次。 3 ml TEN重悬，加DNA提取液，蛋白酶K，50℃1～4 h 加等体积饱和酚，混匀，9000rpm 3 min，小心吸取上层粘稠水相。 氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次，9000rpm 3 min，小心吸取上层粘稠水相。 加2倍体积的异丙醇，用玻棒钩出DNA。 TE溶解。 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 1. 材料准备 2. 细胞裂解 3. 核酸分离、纯化： 4. 核酸沉淀、溶解 三、DNA提取常见问题与对策 DNA提取常见问题与对策 DNA提取常见问题与对策 DNA提取常见问题与对策 第二节 PCR反应 一、PCR反应原理和反应过程 二、PCR标准反应体系： 三、PCR的反应条件（反应参数） 四、PCR常见问题与对策 五、PCR衍生技术（略） 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 二、PCR标准反应体系： 1 模板 单、双链DNA均可。注意模板的完整性，模板降解会导致PCR扩增无产物。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应。 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。 DNA模板一般100ng /100?L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 2、引 物（Primers) 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。。 是化学合成的寡核苷酸， 能与模板特异地结合， 引物决定PCR产物的特异性和长度。 引物设计的原则（一） ①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右. 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。 ②引物扩增跨度： 以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基： G+C含量以40-60%为宜。引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）。Tm在55-65 ℃最好。 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 5℃之内。 引物设计的原则（二） ④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带。 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末