克隆基因的方法精要.pptVIP

* 外源DNA 基因组染色体DNA 基因A 产生突变型 ? 分类： T-DNA标签法 转座子标签法。 * ? T-DNA标签法克隆基因技术路线： 农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。 建立突变体基因组文库及野生型基因组文库. 用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。 用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。 把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。 * 野生株 转基因株 目的基因 染色体 T-DNA 染色体 T-DNA探针 筛选转基因文库 作探针筛选野生株基因文库 构建基因组文库基因苗 构建基因组文库基因苗 阳性克隆 目的基因 获得阳性克隆 基因序列分析，确定为基因 阳性克隆转化突变体，确定基因功能 * 转座子标签法 转座子又称转座因子或者跳跃因子，实际上也是DNA片段，它可以在生物的染色体组中移动，从染色体的一个位点跳到另一个位点，或从一条染色体跳到另一条染色体上，引起基因功能的改变。 * 转座子标签法 最早是美国玉米育种家1951年发现，起初不被认同，1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实后得到认同。 根据DNA的结构和转座的机理，分为两大家族：转座子和逆转座子，前者如玉米的Ac/Ds系统和spm因子，后者如果蝇的copia因子。 * 转座子根据结构不同可以分为简单转座子和复杂转座子 简单转座子：可以直接插入到其他位置,也叫插入序列。 复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记。 结构共同点： 两端含有20-40个核苷酸的倒置重复序列。 含有可编码转座酶的基因。 应用：以Ac/Ds系统为例 * Ac/Ds系统操作原理 把Ac，Ds分别转化并获得转化体。 把Ac转化体同Ds转化体进行杂交得到F1代，然后自交得到F2、F3代分离群体，找出稳定突变个体。 用Ds做probe筛选突变体文库获得突变基因的部分序列。 用上述序列筛选正常个体基因组文库或cDNA文库，得到目的基因。 * 三、 基于基因序列的基因克隆方法 根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆法和通过PCR扩增基因法 * 1、通过分子杂交克隆法原理： 根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分离获得的基因用于制作分子探针，从另一种生物的基因文库中分离出此生物中的同源基因。 * 1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定 2、通过PCR扩增基因法原理： 根据基因序列结构特征，设计基因特异引物，利用PCR技术直接从生物的基因组或是cDNA中扩增出目的基因。 * 提取基因组DNA PCR引物设计 真核生物基因组含有内含子！ 此法适合扩增原核生物基因。 PCR扩增 基因序列分析 * （1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （4）PCR扩增及序列分析 （3）根据目的基因序列设计引物 2）从mRNA中扩增: RT-PCR 原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。 适合扩增真核生物基因。 * 4 、基于基因图谱的基因克隆方法 ?又称图位克隆法，是建立在拥有RFLP等分子标记的连锁遗传图和基因文库，基因产物未知的一种基因克隆技术，理论上可以分离任何一个突变基因。 * 染色体 分子标记A 分子标记B 目的基因 阳性克隆 转化互补实验 基因图位克隆示意图 * 图位克隆基因的一般操作过程： ?通过遗传分析构建与目标基因紧密连锁的分子标记连锁图，达到基因的精细定位。 ?用与目标基因紧密连锁的两侧分子标记筛选基因组文库，构建包含目标基因的基因组物理图谱。 目的基因 标记1 标记2 标记3 标记4 标记5 * 染色体 分子标记2 分子标记3 目的基因 基因组物理图谱 进一步精细定位 获得目的基因 * ?通过染色体步移或染色体登陆技术对目标基因进行进一步精细定位，得到阳性克隆。 ?对阳性克隆转化隐性受体进行功能互补。 ?基因序列测定及表达分析等。 * 影响基因图位克隆的因素： 建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的距离大小。 基因组的大小及可能存在的大量的重复序列。 基因组文库的大小及单克隆的大小。 成功的例子： 水稻Xa21 拟南芥的RPM1，RPS2等。 * 图位克隆基因需满足的条件： 较理想的遗传图谱和物理图谱，如SSR、RFLP图谱。 大片段的基因组文库（BAC ，PAC ，TAC等）。 遗传转化技术。 * 其它的基因克隆法 cDNA捕捉法 RNAi：RNA干涉法 酵母双杂交法 。。。。。。 * 思考题 请简单阐述SH在mRNA水平上克隆差异表达基因的机理。 第三章 基因的克隆方法 * 前言