第四章抗体工程解析.ppt

（2）噬菌体抗体的表达载体：用于噬菌体抗体表达的载体包括噬菌体载体和噬粒（phagemid）。将抗体片段基因与野生型噬菌体基因III的5?端连接，可表达与蛋白III N端融合的抗体片段分子，呈现在噬菌体的表面。噬粒是含噬菌体基因间隔区基因的质粒载体，本身不含噬菌体蛋白编码基因，在导入大肠杆菌后不产生子代噬菌体。当用辅助噬菌体感染时，辅助噬菌体编码的噬菌体蛋白，可将单链噬粒DNA包装成噬菌体病毒颗粒释放出来，其外壳蛋白呈现抗体分子片段，同时含有gp3和gp8，并能再次感染大肠杆菌而繁殖。噬粒具有质粒特性，带有抗药性基因和复制起点，便于筛选含目的片段的克隆和在大肠杆菌内的扩增。 （3）噬菌体抗体分子的亲和力成熟： 如同模拟体内B 细胞经抗原多次刺激后产生的抗体亲和力增加一样，由于抗体基因库的容量大，基因的随机组合及CDR区的碱基突变（可采取PCR错配、随机突变等），可获取高亲和力的抗体基因片段。 （4）抗体分子基因片段的可溶性表达：在噬菌体抗体呈现中，抗体分子片段在融合蛋白的N端呈游离状态，可正确的折叠，形成具有功能的蛋白分子。如果抗体片段基因和外壳蛋白基因（III或VIII）间放置琥珀终止密码子（TAG），则在不带琥珀抑制基因（amber suppressor）的宿主菌中，TAG为终止密码子，合成的抗体分子蛋白多肽穿过细胞内膜，以可溶蛋白的形式分泌表达；而在带有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗体分子多肽以融合蛋白的形式锚定在噬菌体膜上。 1．模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。 建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。 使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。因此，能模拟天然全套抗体库。 二、噬菌体抗体库技术的特点 2．避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能免除使用人工免疫动物和细胞融合技术。 3．可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又都来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。 单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术 宿主细胞: 杂交瘤 细菌 筛选范围 : ~103 107?109 时间: 几个月 几周 操作: 繁杂 相对简单 免疫: 必须 可避免 人源抗体: ? + 费用: 高 低 生产量: 有限 无限 基因获取: 再克隆 直接 应用前景: 有限 不可估 二、噬菌体展示技术的应用现状 抗体： 抗狂犬病毒的单链抗体， 抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并表达有gp120的淋巴细胞, 中和响尾蛇毒素的单链抗， 等等。 疫苗： 展示在噬菌体表面的HIV-1 的gp120-V3 环 可像天然抗原一样引起显著的免疫应答, 等等。 3. 多肽类药物： 如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒 α-bungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促