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第四章 药物定量分析与分析方法验证Quantitative Analysis and Analytical Method Validation 样品处理步骤与分析方法选择 分离、净化和浓集 提取法:液-液提取、液-固提取 液-液提取:选与水不相混溶的有机溶剂进行提取。 提取的关键性问题:提取的选择性和提取率的重复性。 影响提取的因素主要有:水相pH、提取溶剂、离子强度。 固相萃取步骤(以反相柱为例) 活化:6-10倍体积的甲醇或乙腈润洗填料,使其溶剂化;6-10倍体积的水或缓冲液冲洗柱子,使其达到良好的吸附分离状态; 上样:将样品加到柱子上,用抽真空或加压的方法,让样品缓缓通过萃取柱。 净化分离:用适当溶剂洗涤,使感兴趣化合物保留在柱子上,洗除杂质,达到净化目的。 洗脱:改变洗脱剂的极性 和(或)pH,使待测物从柱上解吸,收集洗脱液。 被测组分的浓集 化学衍生化 三、体内样品分析方法与方法验证 思考题 1.常用生物样本有哪些?如何获得? 2.生物样品测定前为什么要除去蛋白质?除去蛋白质的方法有哪些? 3.定量分析方法验证指标有哪些? 燃烧分解 O2 HBr + S2- + SO42- + … HBr + S2- NaBr + Na2SO4 + H2O NaOH, H2O2 Br- + Ag + AgBr 剩余的Ag+ + SCN- AgSCN 例 磺溴酞钠的含量测定 Ch.P (2010) 例 碘苯酯的含量测定 Ch.P(2010) 碘苯酯 I 原理 碘苯酯系有机碘化物,用氧瓶燃烧分解,转变为碘化物,继而氧化为游离的碘,并被定量地吸收于吸收液中,和氢氧化钠反应,生成碘化物与碘酸盐,加入溴-醋酸溶液,使全部转变为碘酸盐,过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾,使与碘酸盐反应析出游离碘,用硫代硫酸钠液滴定,碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点. 滴定度的计算 放大反应 I2 + NaOH→NaIO+NaI 3NaIO→NaIO3+2NaI NaI+3Br2+3H2O→ NaIO3 + 6HBr IO3- + 5I- + 6H+→3I2 + 3H2O I2+ 2S2O32-→2I-+S4O62- 1mol碘苯酯→3 mol I2 →6 molNa2S2O3 反应摩尔比为1∶6 思考题 试述氧瓶燃烧法和凯氏定氮法的原理以及两法的异同。 若用氧瓶燃烧后碘量法测定泛影酸含量,每1 mLNa2S2O3滴定液(0.02 mol/L)相当于多少毫克的泛影酸? C O O H I N H C O C H 3 I I H 3 C O C H N 泛影酸 第五章 体内药物分析 一、常用生物样品的种类、采集和贮藏 血样 血浆(plasma) 血清(serum) 全血(whole blood) 全血+抗凝剂(肝素) 离心 上清液 全血 离心 上清液 全血+抗凝剂(肝素) 混合 注意:采血后应尽快(≤24 h)分离出血浆、血清,再冰冻保存(-20 oC). 尿液(Urine) 收集服药后一定时间内(8 h、12 h、24 h)尿样,记录体积,混匀后取一定量,测定尿中药物浓度,计算一定时间内尿中药物的累积量。 尿中药物浓度变化较大,其变化不能直接反映血液中药物浓度,因此两者相关性较差。 尿中药物以原型、代谢物或缀合物形式存在。主要用于药物剂量回收,肾清除率,代谢类型研究及人群代谢分型研究。 尿液主要成分是水、尿素、盐类,易长细菌,短期(24-36 h)保存可置4 oC冷藏或加防腐剂(如甲苯、氯仿、浓盐酸等),若长期保存则需冷冻保存。 唾液(Saliva) 漱口15 min后收集口内自然流出或经舌尖在口内搅动后流出的混合唾液,离心后取上清。 唾液采集不受时间、地点限制,容易反复采集,采集时患者无痛苦。 唾液组成受各种因素影响,个体差异大,与血浆药物浓度相比,唾液中药物浓度变化不大,且浓度较低。但部分药物在血浆中的游离药物浓度与唾液中浓度相当。因此,可由唾液中药物浓度推断血浆中药物浓度。 组织 头发 二、生物样品分析前处理技术 考虑的因素: 药物的理化性质(酸碱性、亲脂性、挥发性、UV吸收、稳定性、代谢途径等) 药物浓度(ug、ng级) 样本类型(血、组织需除蛋白;唾液需除黏蛋白;尿液需将缀合物水解) 分析技术: 光谱分析(UV、荧光) 色谱分析(HPLC、GC、LC/MS、GC/MS、TLC) 免疫分析(放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、荧光免疫
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