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蛋白质组学 Proteomics 前言 蛋白质组学是当今生命科学的六大研究热点之一 人类基因组计划（human genome project, HGP） 工作目标：测定人类细胞23对染色体上大约3?109 bp 的核酸序列。 HGP1990年正式启动，于2001年发表了人类基因组框架图。 后基因组时代，也称为功能基因组时代。蛋白质组的研究成为后基因组计划的核心内容之一。 2001.2，人类蛋白质组(HUPO)成立。 一、蛋白质组学研究的历史、背景和 相关概念： （一）基因组、基因组学与后基因组计划： 基因组(genome)：细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质，是所有不同染色体上全部基因和基因间的DNA的总和。 基因组学（genomics）：是研究基因组的科学。包括遗传图（genetic map）、物理图（physical map）、序列图（sequence map）和基因图（gene map）构建方法等。基因组学主要探讨基因组的结构特点，也称为结构基因组学（structural genomics）。 后基因组计划(post-genome project ) ：HGP完成后，人们又提出了进一步的探索计划，以探讨基因的功能为目的。研究内容也称为功能基因组学。 功能基因组学的研究角度： 1．基因组多样性的研究：阐述功能基因多态性对机体的影响。 2．比较基因组以及功能缺失突变的研究：观察基因表达被阻断后（基因敲除）在细胞和整体所产生的表型变化。 3．药物基因组学研究：选择药物起效、活化、排泄等相关过程的候选基因进行研究，分析、确定基因序列的变异（突变）与药物的关系等。 4. 基因组的表达及其调控：基因转录表达谱及其调控，蛋白质组研究，生物信息学的应用。 （二）蛋白质组学 转录子组（transcriptome）:一个细胞在特定生理或者病理状态下表达的所有种类的mRNA。 蛋白质组（proteome）由一个细胞，一个组织或一种生物的基因组所表达的全部相应的蛋白质。 蛋白质组是一个动态的概念 。 蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。 蛋白质组学研究的开展是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑 二．蛋白质组学研究的策略和范围： （一）研究策略：???????? 竭泽法：采用高通量蛋白质组研究技术分析生物体内近乎所 有蛋白，是从大规模、系统性的角度看待蛋白质组学。 功能法：研究不同时期细胞蛋白质组成的变化和在不同环境 下的差异表达，以发现有差异蛋白质的种类为主要目标。 （二） 研究范围 蛋白质的表达模式； 蛋白质翻译后修饰研究 ； 大规模蛋白质之间的相互作用；作用网络和复合体组成分析 三 蛋白质组学研究技术基本流程： 生物信息学 样品制备 双向电泳 图像捕获和分析 斑点切取与酶解 质谱分析 数据搜索 LC/MS/MS （一）蛋白质组研究中的样品的制备体系： 1．蛋白质组样品的全息制备： 策略：根据溶解性、在不同细胞器定位进行样品预分级。 注意：材料新鲜，低温、防污染、防降解和蛋白修饰 一般流程： 长至80% 密度的培养细胞（或均一的动植物组织样品），用预冷的PBS缓冲液清洗三次以上 按照1?106细胞加入50?L裂解液（8 mol/L尿素，4% CHAPS，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT） 超声处理，处理时间5s，间歇10s，功率100~120W，直至溶液澄清无粘稠物为止。 4?C，离心，25,000 ?g ?1h 取上清液测定蛋白质浓度，分装后-70?C保存 2．亚细胞蛋白质组样品制备： 亚细胞蛋白质组学（subcellular proteomics）：针对细胞不同区域的蛋白质组学研究,如特定细胞器、多蛋白复合体等 亚细胞蛋白质组学的技术：亚细胞组分的分离纯化技术和蛋白质组技术两大方面。 亚细胞器分离：差速离心法 + 蔗糖密度梯度离心法 自由流电泳技术 其它分子细胞生物学技术 多蛋白组合体的分离：免疫共沉淀法；亲和层析技术 亚细胞蛋白质组学意义：富集低丰度蛋白;完善全细胞蛋白质组，提供蛋白质的亚细胞定位信息；亚细胞蛋白质组的差异表达谱，可灵敏地反映出病理因素造成的蛋白质的量变、质变和蛋白质迁移情况，在细胞生物学研究中表现出特殊的意义。 （二）?蛋白质组研究中蛋白质的分离技术： 1．双向凝胶电泳(2-DE)分离技术： 原理：先采用等电聚焦方法根据蛋白质的等电点差异进行第一向分离，再根据蛋白质分子量的大小进行SDS第二向分离。 分辨率： 一般解析到2000～3000个蛋白质点