核酸提取分析报告.pptVIP

核酸提取 河南农大生命科学研究中心 张志坤 大 纲 一.综述 二.分论 （1）.裂解细胞 （2）.去除蛋白 （3）.去除多糖 （4）.去除多酚 （5）.DNA RNA的分离 （6）.常用的提取方法简介 （7）.核酸质量的检测 （8）.核酸的保存 （9）.操作注意事项 三.结题 一.综述 1.什么是核酸提取？ 核酸提取就是根据核酸和其他细胞组分理化性质的差别，从细胞中将核酸（DNA，RNA）逐级分离并 纯化出来的过程。 细胞的组成成分十分复杂，从结构上来讲，动物细胞及类病毒（衣原体支原体）外层有细胞膜（主 要成分为蛋白和脂类和糖类），细菌及植物细胞外层除了细胞膜外还有细胞壁和荚膜（主要成分是 多糖纤维素类和脂类），病毒外层为蛋白质外壳；细胞中层的内容物中的结构和成分更加复杂， （1）细胞质基质，包括无机离子（K,Cl,Na,Ca,Mg等），各种代谢的中间产物（脂类，单糖，氨基 酸，核苷酸和很多上述产物的中间体），蛋白质（包括酶类），脂蛋白，RNA mRNA，tRNA,rRNA和 很多小RNA及RNA的中间体 ，（2）核糖核蛋白体（蛋白质合成的场所），（3）线粒体及质体 其结 构和组成类似于细胞，同样有质膜，基质，骨架等，有些还有独立的遗传系统 ，（4）内膜系统 （主要是脂类和蛋白质，核糖核蛋白体附着在内膜上，是蛋白，酶，脂类，糖类合成的场所），（5） 液泡（主要是脂类，蛋白，和液泡基质），（6）细胞骨架（主要是蛋白质，支撑细胞正常形 态），（7）细胞外基质 主要是蛋白类物质，将同类细胞连接在一起 ，（8）细胞核（核膜，核 仁，核内容物，主要是DNA,RNA,蛋白质等）。 一.综述 一.综述 2.细胞组成成分 一.综述 3.为什么要提取核酸？ 从组织中提取核酸是进行分子生物学方面研究的必要前提。要进行Southern,Northern 杂交分析,克 隆基因，基因检测，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA 文库,RT - PCR 及差示分析等分子生物 学研究,都需要高质量的核酸。因此,从组织中提取纯度高、完整性好的核酸是顺利进行上述研究的 关键所在。核酸提取是进行所有分子生物学研究的基础，没有高质量的核酸，分子生物学无从谈 起，因此核酸提取是分子生物学的一项基本功，大家一定要掌握。 4.核酸的理化性质 （1）.溶解性（分离纯化核酸的重要依据） 它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因 此，常用乙醇异丙醇等有机溶剂从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙 醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。 DNA能溶于酸性苯酚中，而RNA不溶于酸性苯酚，此性质常用作分离DNA和RNA。在碱性苯酚 （PH 7.8）中，DNA和RNA都不溶解。在纯化DNA时，苯酚一定要平衡，确保其PH 7.8。 在一些高盐溶液中（如NaAc和LiCl），DNA和RNA的溶解性不同，据此可用不同浓度的盐溶液选 择性地沉淀DNA或RNA。 一.综述 4.核酸的理化性质 （2）.解离性（核酸电泳的依据） 因为带有磷酸根，所以核酸是带有电荷的，据此我们进行核酸电泳，来鉴定核酸的分子量及完整性等。 （3）.紫外吸收性（紫外检测的依据） 由于核苷酸的嘌呤嘧啶碱中具有共轭双键，因此核酸对紫外线有强烈的吸收。在260nm附近有最大吸收峰，在230nm有一个低谷。根据230nm,260nm,280nm,320nm处的吸收峰，我们可以对核酸进行纯度和定量检测。 （4）.变性，复性和杂交（PCR及分子杂交的依据） 核酸具有全部 DS-DNA 或局部（SS-RNA）的双链结构，某些物理化学因素能破坏核算中的氢键，使有规律的双链结构打开，变成单链，此过程称为核酸的变性。如加热（DS-DNA94℃左右，SS-RNA70℃左右）酸或碱及某些变性剂。 变性的核酸在适当条件下，又可使彼此分开的链重新结合，此过程称为核酸的复性。如降低温度，去掉变性剂等。在变性和复性的过程中，有很多可人为控制的反应能够发生，如PCR时引物的与模板的结合等。 不同来源的具有互补序列的两条单链核酸分子在变性复性的过程中，也可以结合形成双链分子，此过程被称为核酸的分子杂交。包括DNA-DNA分子杂交，DNA-RNA分子杂交和RNA-RNA分子杂交，即Southern-Blot,Northern-Blot。分子杂交常被用于检测某条基因的丰度。 一.综述 5.核酸提取的一般步骤 二.1 裂解细胞 1.为什么要裂解细胞？ 裂解细胞的目的是为了破除细胞壁，细胞膜让细胞内容物尽快的释放出来，从而为提取核酸做好准备。裂解细胞的过程就是我们在和核酸酶赛跑的过程，裂解细胞是提取核酸很重要的一环，直接关系着核酸的质量和得率。 2