第八原生质体培养和体细胞杂交精要.ppt

第八章 原生质体培养和体细胞杂交 一、原生质体研究概况 （一）、原生质体的基本概念 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞,即，植物细胞或细菌细胞去除细胞壁后剩余的部分。 （二）、原生质体研究进展 1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast) 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。 1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。 目前已有320多种以上植物的原生质体培养成功 （三）、原生质体研究的意义 1、再生植株 2、用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交获得杂种植株（创造细胞质杂种）。 3、遗传转化的良好受体 4、基础理论研究的实验材料 （一）、植物材料 要获得高质量的原生质体。必须选用生长旺盛、生命力强、幼嫩部分作为材料。 1、愈伤组织及细胞悬浮培养物 外植体 诱导出愈伤组织 筛选 悬浮培养 培养至3～4个月后，悬浮培养物大小一致，较浓时作为分离原生质体的材料 2．叶肉细胞 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料。 植株的生长环境，叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。 要获得良好的培养下列外界因素是考虑的重要因子： （1）光强为3000～6000lx。 （2）温度为20～25℃培养。 （3）相对湿度在60％～80％左右。 （二）、原生质体的分离方法 1.机械分离法 2.酶分解法 3、植物材料的预处理 预处理能提高原生质体的分裂能力，以及对对培养环境的适应能力。 暗处理 叶片预培养 预先质壁分离 （三）、酶 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ①纤维素，占细胞壁干重的25 ％至50％不等； ②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右； ③果胶质，一般占细胞壁的5％。 细胞壁结构： 中胶层（又名胞间层）：主要成分是胶粒柔软的果胶质. 初生壁：主要成分是纤维素、半纤维素和少量的果胶质.具有较大的可塑性,既可使细胞保持一定形状,又能随细胞生长而延展. 次生壁：主要成分是纤维素.坚硬,使细胞壁具有很大的机械强度. 1、酶的种类(主要的酶） 纤维素酶：是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C，降解纤维素 果胶酶：是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解 半纤维素酶：降解半纤维素为单糖或单糖的衍生物 2、渗透压稳定剂 ①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。 ②盐溶液系统：包括 KCL、MgSO4和 KH2PO4等 3、酶液的PH值 酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大，往往降解酶的PH与细胞活力最适PH不一致 常用PH5.4—6.0 4、酶液的 温度 一般在26±1℃ （四）、原生质体的制备与活力检测 原生质体纯化方法： 过滤离心法，比较适用于分子量较小的甘露醇等作为渗透稳定剂的。 漂浮法，比较适用于分子量较大的蔗糖作为渗透稳定剂的分离。 原生质体活力检测 目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），死细胞内无荧光现象。 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。 藏红花红染色法，死细胞着色，活细胞不染色。 （五）、影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 三、原生质体的培养 （一）、固体培养法 该法是将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培养基等量混合，使琼脂的最终浓度为0．6％左右，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。由于原生质体被机械地彼此分开并固定了位置，避免了细胞间有害代谢产物的影响并便于定点观察，追踪单个细胞的发育过程。 （二）、浅层液体培养法 含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。这种方法操作简便，对原生质体伤害较小 。 微滴培养法是液体培养的一种方式。将悬浮有原生质体的培养液用滴管以0．1ml左右的小滴接种在无菌且清洁干燥的培养皿上。 （三）、双层培养法 在培养皿的底部先铺一薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体的液体浅层培养。