EST之详细教程详解.docVIP

Expressed Sequence Tags（ESTs） 何谓Expressed Sequence Tags（ESTs）？ 从一特定细胞族群之mRNA转录而成的一群cDNA，经过single-pass的定序过程，而得到的一组序列。此一细胞族群可以是特定的组织、器官，或是处于某特定发育状态或环境的细胞。 A set of single-pass sequenced cDNAs from an mRNA population derived from a specified cell population (e.g. a specific tissue, organ, developmental state or environmental condition).〈2〉 ESTs之发展演进 快速产生大量低质量的cDNA之概念在1980年代晚期被提出，此方法所能带来的利益，在当时并未能被普遍地认同。提倡者认为这些cDNA序列能让很多新的protein-coding gene很快地被发现。批评者则提出反驳，认为这些cDNA序列将会遗漏掉许多原本能在genimic DNA中被找到的重要调控要素（regulatory elements）。最后，还是由提倡cDNA定序的人赢得了胜利。1991年时，有609个Expressed Sequence Tags（ESTs）首度被描述，而公用数据库（public databases）中ESTs的数量，更是呈现戏剧性的成长，到了1995年中，GenBank里ESTs records的数量已超过非ESTs records的数量；2000年六月，四百六十万的ESTs records已占了GenBank里所有序列的百分之六十二。一开始，ESTs的来源只有人类；现在NCBI的EST database（dbEST）已包含了超过250种生物来源的ESTs，包括小鼠（mouse）、大鼠（rat）、Caenorhabditis elegans和黄果蝇（Drosophila melanogaster）等。除此之外，也有数个商业性的机构维持了一些属于机构内部不公开的ESTs collection。现在ESTs已被基因体学及分子生物学界，广泛使用于基因的发现、mapping、多型性的分析、expression studies和基因的预测。 ESTs之构筑与种类 建构ESTs的概要流程如下：从有兴趣的组织或细胞株分离出mRNA并反转录成cDNA，将这些cDNA clone到载体（vector）上，建构一cDNA library。再从library中挑选出个别的clone，分别从cDNA insert之5’端及3’端进行定序，因此，每个clone一般来说会有一个5’ EST和一个3’ EST（图一）。序列的长度平均约400个bases。因为ESTs很短，所以它们通常只相当于基因的部分片段，而非完整的coding sequences。许多定序的中心已经有产生ESTs的自动化程序，能以很快的速度产出ESTs。举例来说，公元2001年，华盛顿大学的Genome Sequencing Center，每星期就能制造出超过20,000个ESTs。 迄今，被submitted到公共序列数据库（public sequence databases）的ESTs产生自上千个不同的cDNA libraries-超过250种以上的生物体。这些libraries可能来自整个器官，例如：人类的脑、肝脏、肺脏或骨骼肌等；或来自特化的组织或细胞，例如：大脑皮层、表皮的角质细胞；或者来自培养的细胞株，例如：liver HepG2或gastric carcinoma。有些libraries的建构是为了比较不同发育时期的transcripts之差异，例如：人类胎儿对婴儿脑部之比较，或7天大的大鼠（rat）胚胎对10天大的新生儿心室的比较。另外有些libraries则是用来强调，在正常组织与被转形的（transformed）组织间，基因表现的差异性，例如：正常的结肠上皮细胞和结肠直肠癌的细胞株。 Libraries的建构是从有兴趣的组织或细胞株分离出mRNA，再将mRNA反转录成cDNA，通常会使用oligo(dT) 当作primer，因此cDNA的一端会来自于mRNA末端的polyA。而cDNA的另一端通常位在coding sequence里面，或者如果coding sequence较短的话，也可能位在5’端的非转录区（untranslated region）。接着再将产生出来的cDNA接（clone）到载体上。在许多libraries中，cDNA接到载体上是有方向性的。而有些libraries会将代表个别mRNA种类之clones发生的频率缩在一个范围之内