第二柱色谱精要.ppt

色谱法基本原理 色谱分析的目的：将样品中各组分彼此分离。 两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相中的分配系数决定的，与色谱过程的热力学性质有关。两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，仍然不能分离。峰的宽窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两方面研究色谱行为。 吸附层析 是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。 吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。 层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。 在洗脱时，层析柱内不断发生吸附、解吸、 再吸附、再解吸的过程 选择吸附剂时，注意: 吸附剂应有适当的吸附力，表面积大； 颗粒均匀，在操作时稳定，不会破裂； 对被吸附物的吸附应是可逆的，即在一定条件下可以解吸，以便洗脱； 不会溶解在所采用的溶剂中，也不会引起被吸附物的化学变化； 对被分离物有足够的分辨力，即对不同物质的吸附力有所不同。 吸附剂不应含有杂质，否则需经预处理后使用(除去杂质，增加吸附力，提高层析分离效果) * 离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。 凝胶层析 又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的 常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。 酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用. 第二章 色谱分析 柱色谱 纸色谱、薄层色谱 气相色谱 高效液相色谱 1 色谱法概论 1.1 色谱分析法的发展概况 (1)色谱法（chromatography）：是一种利用物质的物理化学性质建立起来的分离、分析方法。广泛用于复杂化合物的分离分析。 当流动相流过含有样品的固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。固定相可以是固体，也可以是以被固体或凝胶所支持的液体，可以装入柱中，也可以展成薄层或涂成薄膜。流动相可以是液体，也可以是气体。 色谱法的特点：选择性高；灵敏度高，样品用量少；分离效率高，分离速度快；应用范围广。 实质：分离 目的： 定性分析：出峰时间 定量分析：峰面积 纯度鉴定：出峰数量 固定相——CaCO3颗粒 流动相——石油醚 色带 （2）色谱法的由来：1906年由俄国植物学家Tsweet创立。首先用于植物色素分离。 (3)色谱法的发展 1931年德国的Kuhn和Lederer重复了Tswett的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素。1938年Kuhn因研究类胡萝卜素和维生素获诺贝尔化学奖。 30、40年代相继有了薄层色谱法和纸色谱法。 Martin和Synge在1940年提出液液分配色谱法，即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法，因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。 50年代后期出现了气相色谱-质谱联用技术。 60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，发展了高效液相色谱法。 1.2 色谱法基本原理 色谱分析的目的：将样品中各组分彼此分离。 两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相中的分配系数决定的，与色谱过程的热力学性质有关。