流式细胞术的原理2010__12__21.ppt

流式细胞术的原理 BD生物科学 王淑琦 “备”则“倍” 有准备、有规划的人生更精彩！ 样本来源 血液 骨髓 淋巴结 体液 （尿液、脑脊液、胸腹腔积液） 灌洗液（肺泡支气管） 加抗凝剂（EDTA），室温保存，24h内 实体组织 机械法制备单细胞悬液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性剂 2.免疫荧光染色 染色方式的选择 直接染色 — 标有荧光染料的抗体直接特异结合目标抗原。 —首选的方式：方便快捷、经济、准确、非特异结合少 间接染色 —标有荧光染料的二抗间接特异结合目标抗原。 — 在直接染色不能实现的情况下，选用的方式： 非特异性结合相对增加。在流式试剂日益全面的情况下，越来越少的客户选择这种方式。仅适用于研究最新发现抗原的客户。 荧光染料的选择 1，首先，了解目标抗原 1）细胞表面抗原 2）细胞内或是核内抗原（固定、透膜步骤） 3）以上两者兼备。先标记表面抗原，固定后，破膜标记胞内抗原。 4）细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂，如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。（活化、固定、透膜） 2，了解荧光染料及其工作原理，做出准确的选择。 荧光染料的种类 荧光染料分为 三大类 1. 小分子化合物： FITC、Pacific Blue 2. 大分子荧光 蛋白：AmCyan， PerCP，PE, APC 3. 串联染料： PerCP-Cy5.