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分离纯化过程中蛋白质的稳定性 孙万儒 中国科学院微生物研究所 蛋白质的结构 蛋白质的稳定性 失活机理 失活机理 失活机理 失活机理 失活机理 物理因子 化学因素 化学因素 生物因素 酶结构和稳定性 酶结构和稳定性 稳定化策略和方法 稳定化策略和方法 稳定化策略和方法 稳定化策略和方法 稳定化策略和方法 稳定化策略和方法 稳定化策略和方法 稳定化策略和方法 稳定化策略和方法 蛋白质在后处理过程中的失活 细胞破碎过程的失活 细胞破碎过程的失活 细胞破碎过程的失活 干燥过程的失活 干燥过程的失活 干燥过程的失活 谢谢！ * 蛋白质的稳定性主要是指保持其生物活性的能力。与蛋白质结构，构象有关。 关系到分离纯化的活性收率，生产成本。 关系到蛋白质制剂能否应用和商品化。 在分离纯化过程中关注的是： 那些因素影响蛋白质稳定性。 如何减少活性损失，保持稳定 失活包括两个步骤： N D I 天然态N：肽连正确折叠，紧密，球或棒状 分子， 自由能最低(40-120kj/mol)。 过度态D：构象变化，包括若干中间态，可逆，部分 或大部失活。 失活态 I ：完全变性，无序结构，不可逆，自由能最 高(＞400kl/mol)。包括共价键变化、SH氧 化、SS键还原、磷酸化、脱氨。 天然态在一定程度上仅是热力学稳定，低自由能使其倾向于不稳定，环境的微小变化也会引起负自由能变化。自由能仅决定平衡时的天然态和可逆变性态的比例，不能说明达到平衡的速度。 达到平衡时的速度是由变性和复性的自由活化能决定。变性活化能不同于天然态和活化态的自由能；复性活化能不同于活化态和变性态的自由能。 失活机理 变性条件 1. 凝聚(有时伴随S-S键形成） 热，盐酸胍，脲，SDS， 震荡 2. 一级结构改变 ? H+和OH-催化肽键水解，酶水解， 极端pH，热，蛋白酶 自水解 ? 功能基团氧化（SH,吲哚环） 氧化(特别是加热)和它 的代谢物 ? S-S键还原，分子内SH与S-S交换 热，高pH，硫醇，二 硫化物 ?分子内S-S键再交换 高pH，加热 失活机理 变性条件 ?重要SH修饰 金属离子，二 硫化物 ?蛋白质磷酸化 蛋白质激酶 ?催化活性中间物引起的‘自杀失活’ 底物 ?氨基酸消旋 加热，高pH ?次级序列形成的S-S键断裂 加热，高pH ? Asn脱氨 加热，高pH 失活机理 变性条件 3. 辅酶从活性中心上解离 螯合剂，硫醇，透析，金属离子，