第二章基因工程载体和工具酶分析.ppt

第二章 基因工程载体和工具酶 湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲 本章目录 2.1 载体 2.1.1 质粒载体 2.1.2 噬菌体载体 2.1.3 其他载体 2.2 工具酶 2.2.1 限制性核酸内切酶 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 2.2.3 DNA连接酶 2.2.4 碱性磷酸酶 2.2.5 末端脱氧核苷酸转移酶 第二章 基因工程载体和工具酶 1. 质粒 plasmid 细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双链DNA 大小：1-200kb 能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系 复制分松弛型和严谨型两种 松弛型：10-200 拷贝（加氯霉素扩增） 严谨型： 1-10 拷贝 有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的 天然质粒 LacZ基因表达的蓝白斑菌落 基因工程质粒：Plasmid pBR322 松驰型质粒 Ampr， Tetr 多种限制性酶切位点 全长 4362 bp Plasmid pBR322结构图 Plasmid plink 322 在pBR322基础上改建，增加了一个多接头（polylinker），即增加了多克隆位点。 全长 3.8 kb Plasmid plink 322 pUC 质粒(University of California) pUC 质粒 是由大肠杆菌 pBR322 质粒 与M13 噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体 pUC 18/pUC 19 全长 2674 bp ，有 Amp 抗性基因，一个复制起点ori。带有lac Z的N端 标记序列；因在复制起点ori区域内缺失 rop 基因（改进的pMB1复制子），细胞即使生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700）。 宿主菌携带β－半乳糖苷酶C端序列。重组子菌落是白色，空转化子是蓝色。 Plasmid pUC 18/pUC 19 结构 改建质粒的要求： 尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段； 增加多种酶切位点； 增加标记基因； 提高外源DNA的表达水平； 增加质粒在受体细胞中的拷贝数 转化子的筛选方法 遗传标记筛选（载体与目的基因本身） DNA片段大小检测 核酸分子杂交 目的基因表达产物检测 质粒DNA提取的策略 质粒DNA的提取 细菌细胞破碎----碱使染色体DNA变性-----离心分离------收集质粒DNA-----纯化------保存 真核细胞DNA的提取 研磨使细胞破碎-----蛋白酶K去核蛋白----分离蛋白质与DNA------纯化-----沉淀------纯度检测 质粒DNA的纯化 RNA酶去RNA SDS-蛋白复合物 蛋白酶K去蛋白质 酚-氯仿抽提 纯化试剂盒 紫外分光光度计测A260与A280值：1·8 或2·0 质粒DNA沉淀 二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。 乙醇沉淀时，加NaAc or NaCl至终浓度为0·1-0·25M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。 0·6倍体积的异丙醇沉淀，-20°C半小时。 DNA分离 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 氯化铯密度梯度离心 DNA浓度检测 琼脂糖凝胶电泳 0.05-0.1μg EB-标准DNA浓度比较: 1 ng 紫外分光光度计测A260: 0.1-1 ideal, 0.05-1.5 accepted 纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。纯DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。 EB与DNA DNA大小测量 凝胶上与标准分子量比较 λHindIII 100bp ladder 自己的marker 在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？ DNA浓度 DNA大小 波长 纯度 EB量等有关 DNA电泳结果分析 2. λ噬菌体 λ 噬菌体DNA 是线性双链DNA分子，48.5kb 噬菌体λ粒子，DNA线性双链，带有12bp的粘性末端，称为cos位点。 噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状 Λ基因组三个区域： 左侧：包括外壳蛋白基因，20kb 中间区：18kb 右侧：复制及裂解基因，12kb λDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源片段 4. 柯斯质粒cosmid 1978年由Collins和 Hohn改建 正常的质粒与噬菌体的cos位点构成 有Amp，Tet 抗性基因 Cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装 5.人工微小染色体 YAC,