宏基因组学在基因发现中的应用分析.pptVIP

宏基因组学在基因发现中的应用 一、宏基因组学简介 宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学 其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA（也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息 为什么要研究宏基因组学？ 在自然条件下,微生物广泛参与Ｃ、Ｎ、Ｏ和Ｓ等重要元素的循环转化,并在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应、环境污染物降解等方面发挥着重要作用 微生物通过其群落而非单一个体来执行这些重要功能,而目前人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养的单一微生物物种,对微生物群落作为整体的功能的认识远远落后于对其个体的认识 二、研究方法及应用 研究方法以基因组测序技术为依托 主要程序： 1、从环境样品 (例如土壤 )中直接提取 DNA; 2、将 DNA克隆到合适的载体中; 3、将载体转化到宿主细菌建立环境基因组文库; 4、对得到的环境基因组文库进行分析和筛选 宏基因组学的应用： 三、在基因发现过程中的应用 宏基因组文库的筛选方法是新基因发现的一种新策略 基因组文库的构建是揭示新基因的前提，如何有效地利用文库中丰富的资源,挖掘新的生物分子是关键 由于环境基因组的高度复杂性,需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因 第1类基基于克隆子的特殊代谢活性(功能驱动) 第2类于核酸序列差异分析(序列驱动) 第3类基于底物诱导基因的表达 第4类基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其它技术. 1、功能分析法 以活性测定为基础 ,通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆 依赖于功能基因或编码功能蛋白在外源宿主中的表达 能够在各种选择性平板上通过可见性状筛选的到产生脂酶、淀粉酶、七叶苷水解酶、甘油脱水酶及抗菌活性的克隆子 方法一：对具有特殊功能的克隆子进行直接检测 ； 方法二：基于异源基因的宿主菌株与其突变体在 选择性条件下功能互补生长的特性进行 2、序列分析法 根据已知的基因和基因表达产物的保守序列设计引物和探针，通过杂交或PCR扩增鉴定出已知基因的同源物,进而筛选阳性克隆子 对鉴定新的基因成员有一定的局限性 ,但它已被有效地用于鉴定系统发育学中的标志基因(如 16S rRNA基因 )和带有高度保守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、葡萄糖酸还原酶和腈水合酶等 ) 2.1 随机鸟枪法（Shotgun sequencing） 将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 ,分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关系进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中的正确位置 。 优点：为筛选新的天然产物提供了一种可选择的途径, 从中挖掘上百万个新基因,揭示不可培养微生物的代谢途径. 缺点：耗费大,需大量人力和物力；与个体微生物基因相比,对序列片段进行分析则极为困难。 2.2 焦磷酸测序( Pyrosequencing) 焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔 ,将基因组 DNA进行随机切割 ,批量地进行整个测序反应，能够在相同的时间内破译 6 × 106组以上的基因组序列 ,比 Sanger法要快100倍 ,提高了测序的效率。 由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。 原理：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5-磷酰硫酸、荧光素。 测序过程: 脱氧核苷酸三磷酸(dNTP) DNA聚合酶↓（能和DNA模板的下一个碱基配对） 添加到测序引物的3’末端 ↓ （释放） 焦磷酸(PPi) ATP硫酸化酶↓加入 APS 特异的检测峰 ↓ ↗ （微弱光检测） ATP→→→→氧化荧光素（产生可见） 加入荧光素 3、底物诱导基因表达法 第一步：以 p18GFP为载体构建宏基因组文库； 第二步：在无底物情况下以异丙基 —β2D硫代半乳糖苷 基因