基因打靶技术分析.ppt

基因打靶技术及研究进展 2007诺贝尔奖专题 瑞典卡罗林斯卡医学院10月８日宣布，２００７年诺贝尔生理学或医学奖授予来自美国的马里奥·卡佩奇、奥利弗·史密斯和来自英国的马丁·伊文思因胚胎干细胞研究获该奖项。　　这三位科学家是因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”而获得这一殊荣的。这些发现导致了一种通常被人们称为“基因打靶”的强大技术。这一国际小组通过使用胚胎干细胞在老鼠身上实现了基因变化。 建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术(Gene targeting)是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。通过对生物遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，疾病发生的分子机制，提供相关的疾病治疗药物、评价模型及新型预防、治疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段。 基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。 基因敲除：是使基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。 基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。 一、基因打靶研究的背景 目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现： ①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺如； ②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性； ③外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因； ④导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。 为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。 二、基因打靶原理 生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。 同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。 早在20世纪初，Morgan等人通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的DNA重组是产生交换的基础。1985年在哺乳动物细胞中实现了同源重组。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。 ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。自从1981年美国的Gail和英国的Evans等 分别成功地从发育中的小鼠囊胚的内细胞团（inner cell mass）分离出胚胎干细胞, 随后, 又从原始生殖细胞——一种最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中得到具有胚胎干细胞相似特性的细胞群，称为胚胎种系(embryonic germ，EG)细胞。 胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。 1984年， Bradly等成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的动物模型。此后，这项技术得到了普遍应用和长足发展。 三、打靶载体的构建 基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基因置换