基因工程表达许亚芳分析.ppt

8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克60秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却5分钟。 * 重组子的筛选 重组子的筛选方法常用的方法： 抗生素筛选法 互补法 阳性质粒直接检测法 抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 * 9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃ 200rpm 摇床培养30分钟。 10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟 11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。 互补法 许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主细菌带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列。宿主细菌和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。 Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。 * 涂布棒的使用 1.使用前，浸入75%酒精中； 2.在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）； 3.等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却； 4.涂布均匀； 5.将涂布棒重新除菌以备下一次使用。 阳性质粒的筛选鉴定 （1）重组质粒的提取 ①挑取阳性单菌落，接种到含Amp（终浓度：100 μg/mL）的LB液体培养基中，恒温摇床，37 ℃培养过夜。 ②次日，取1 mL上述过夜培菌液放于1.5 mL离心管中，4℃，12000 rpm，离心2 min，弃去上清，尽可能吸净培养液。 * ③在上述菌体沉淀中加入100 μL冰预冷的裂解液Ⅰ，充分混匀并剧烈振荡。 ④震荡完毕再加入200 μL现配的裂解液Ⅱ，盖紧管口，缓慢颠倒离心管数次。 ⑤再向离心管中加150 μL预冷的裂解液Ⅲ，盖紧管口，温和震荡10 s，置于冰上3~5 min。4 ℃，12000 rpm，离心8 min，把上清转移到另一新灭菌的离心管中。 * ⑥取400 μL酚/氯仿加入到含上清的离心管中，充分混匀，放置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心，8 min。 ⑦可以看到离心管中有明显的分层，小心的取出上清溶液于另一支新离心管中（避免吸入下层溶液），在离心管中加入700 μL的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温放置3 min，沉淀核酸。在4 ℃条件下离心，12000 rpm，离心5 min。用移液枪吸去上清液，然后将离心管倒扣一吸水纸上，室温下自然挥发20 min，除去异丙醇。 * ⑧待离心管底会有白色的沉淀，在离心管中加如800 μL 70 %乙醇，上下颠倒离心管数次，洗去异丙醇，在4 ℃条件下离心，12000 rpm，离心2 min，弃去上层溶液。打开离心管，放置室温使酒精自然挥发。 ⑨于离心管中加入50 μL TER，其中TER中含有去DNA酶的胰RNA酶（100 μg/ml），室温放置30 min使RNA降解，贮存于-20 ℃。 * 质粒提取所用溶液 1.裂解液Ι（100 mL )： * 加入去离子水至100 mL，充分混合均匀，4℃存放。  * 加入去离子水至100 mL，充分混合均匀，室温存放。 2.菌体裂解液Ⅱ（10 mL）： 3.裂解液Ⅲ （100 mL）： * 加入去离子水至100 mL，充分混合均匀，4 ℃存放。 4.苯酚/氯仿/异戊醇（100 mL）： * 上述试剂混匀后，在溶液上层加入5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），用来隔绝空气，4 ℃保存。 5.10×TE缓冲液： * 121 ℃，高压灭菌30 min，分装到1.5 mL离心管中，贴标签，-20 ℃存放备用。 （2）双酶切鉴定 在灭菌的0.5 mL离心管中加入40 μL体积的双酶切反应体系： * 轻轻混合均匀，稍加离心，37 ℃ 酶切4 h，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。 （3）测序鉴定 将酶切鉴定正确的菌株进行测序。 * 目的基因的检测与鉴定 检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ① 首先取出转基因生物的基因组DNA； （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: ②