基因工程与基因组学分析.pptVIP

第11章 基因工程和基因组学 第一节 基因工程 基因工程概念： 广义：包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等 狭义：基因工程 一、基因工程概述 20世纪70年代初，DNA重组技术的发展而产生 1971, 美国Smith, H. O. 细菌 限制性酶，酶切病毒DNA分子——DNA重组时代的开始 1972, Berg, P. 猿猴病毒DNA λ噬菌体 DNA 1973，Cohen, S 酶切后的外源DNA分子 + 质粒 1982，美国食品既药物管理局批准， 首例基因工程产品进入市场——细菌中表达人胰岛素 1985，转基因植物获得成功 1996，克隆羊诞生 基因工程—— 改造，创建生命形态； 生产药品、疫苗、牛奶和食品； 诊断和治疗遗传疾病； 成为当今人类社会日常生活的组成部分。 DNA重组 ——创造自然界没有的DNA分子新组合 分子生物学、核酸化学、微生物遗传学的现代方法和手段——综合技术 包括： 1. 从细胞和组织中分离DNA 2. 识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶酶切DNA分子，制备DNA 3. DNA片断 + 载体 重组DNA分子 4.重组DNA分子 宿主细胞 产生多个相同的拷贝，克隆clone 5.重组DNA分子 通过细胞分裂分配到子细胞中 6. 从宿主细胞中回收、纯化、分析克隆的重组DNA分子 7. 克隆的DNA能转录成mRNA、翻译蛋白质。能分离、鉴定基因产物 二、限制性内切核酸酶 基因工程的工具、基石 功能： 识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，切断双链的DNA。 降解细菌中外来的DNA 分子,限制、阻止细菌的侵染。 已经分离出200多种限制性内切核酸酶，可分两类 每隔一段DNA 序列随机切割双链DNA分子（无序列特异性 ） 准确识别双链DNA特异序列（基因工程中广泛应用） 双链中，识别的序列是对称的：回纹对称序列（palindrome） 双链DNA被切割后产生两个相同的单链粘性末端（stiky end） EcoRⅠ 部分常用的限制性酶 三、载体 作用： 经过酶切的DNA片断，只有和适合的载体（vecter）DNA连接构成重组DNA分子，通过载体进入宿主细胞（ host cell ），在宿主细胞中复制、扩增、克隆出多个拷贝。 可作为DNA载体的有： 质粒、噬菌体、病毒、细菌、酵母人工染色体BAC、HAC等 作为载体的DNA分子需具备的条件： 具有复制原点（ori）,在宿主细胞中独立自我复制，携带的外源DNA片断一起复制。 多克隆位点（multiple cloning site,MCS或polylinker region),具有多种限制性酶切的切点，每种酶切的切点只有一个，切点不在复制原点、抗生素选择标记基因内。 有选择标记（至少一个），抗生素、某种酶，而宿主中没有这种基因 容易从宿主细胞中回收。 1. 细菌质粒 独立于细菌染色体而自然存在，自我复制、容易分离和导入，环状双链DNA分子。 用于克隆分子量 10 kb 的外源DNA 片断，应用范围广，拷贝数多。 重组型检测标记 在DNA克隆中 根据宿主表型 质粒是否带外源DNA 片断 Puc18 分子量小（接受较大片断）、拷贝数多（500）、多克隆酶切位点（克隆方便）、 α-互补显色表型（检测标记） 2. λ 噬菌体 全长49kb 可接受15-23kb外源DNA片断 特点： 克隆载体，表达载体 用作cDNA、核DNA的克隆载体 基因库的筛选中， λ 噬菌体作载体与细菌质粒相比，容易操作、阳性克隆数多，用于各类基因库的构建 3. 柯斯质粒 柯斯质粒(cosmid):部分λ 噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成。 组成（ λ 噬菌体的cos序列12bp、细菌质粒的复制原点）： cos序列：噬菌体DNA 包装成噬菌体时所必需的 质粒的复制原点：柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样进行自主复制 抗生素抗性基因 4. 穿梭载体（shuttle vecter） 能在两种不同的生物中复制的载体