《生物化学》蛋白质化学.分析报告.ppt

(七）蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 蛋白质含量测定 凯氏定氮法 双缩脲法 Folin-酚法（Lowry法） 紫外吸收法 mg/ml=1.45A280-0.74A260 染料结合法 考马斯亮蓝G-250 蛋白质的分类 分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能 （一）按分子形状：球状蛋白和纤维状蛋白； （二）按分子组成：简单蛋白和结合蛋白； （三）按溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等。 * * * * * * * * * * * Typical calibration curves obtained with standard proteins separated by nongradient denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis based on the method of Laemmli (1970). (A) Gel with 7% polyacrylamide. (B) Gel with 11% polyacrylamide. (Redrawn with permission from Sigma.)  Separation of membrane proteins by 5.1% to 20.5% polyacrylamide gradient SDS 分子量测定 根据化学成分测定最小相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量： 最小相对分子质量＝（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量 如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。 分子量测定——超速离心法 在60 000～80 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动 用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关 沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。 一个S单位，为1×10-13秒 相对分子质量越大，S值越大 蛋白质的沉降系数：1～200S 由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量： M=RST/D〔1－iρ〕 R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ρ：溶剂的密度 分子量测定——超速离心法 分子量测定——凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量 分子量测定——凝胶过滤法 分子筛— 凝胶过滤法 （二）两性电离与等电点 应用电泳法： 分离各种蛋白质；鉴定蛋白质的纯度。 此多用于科研、生产、临床诊断等。 （三）胶体性质 蛋白质水溶液为亲水胶体。 不能通过半透膜； 分子周围有同种电荷和水化膜，有利于稳定pr胶体系统。水化膜、同种电荷 超滤 透析 （四）呈色反应 反应 试剂 颜色 反应基团 双缩脲反应 NaOH,稀CuSO4 紫或粉 2个以上肽链 Millon反应 Millon,硝酸，亚硝酸 红色 酚基 黄色反应 HNO3及NH3 黄、橘黄 苯环 乙醛酸反应 乙醛酸H2SO4