第9章微生物与基因工程概要.ppt

二、λ噬菌体克隆载体 将野生型λ噬菌体DNA进行改造后建成，主要是去掉噬菌体DNA上过多的常用限制酶的酶切位点，及对非必要基因区域进行改造。 特点(P275第四段)： 1）分子遗传学背景清楚； 2）容量较大（能容纳大约23kb的外源DNA片段）； 3）感染效率高。其感染宿主细胞的效率几乎可达100％， 而质粒DNA的转化率却只有0.1％。 4）具有更为狭窄的寄主范围，更加安全。 （参见P275） 与溶原性相关的基因可以被外源DNA取代而不影响 λ噬菌体的感染、复制和裂解宿主细胞的能力。 重组噬菌体DNA也可不经过体外包装 而直接通过转染 方式进入宿主细胞； 经过体外基因操作和包装后形成 重组噬菌体，可以通过正常的感染 途径进 入宿主细胞； 质粒和噬菌体载体都可用于 构建基因文库； 但后者更有优势： 容纳的外源DNA片段较大； 以感染途径进入宿主细胞的 效率比转化高； 第四节 微生物作为克隆载体的宿主 一、宿主的基本要求与性质 ①高效吸收外源DNA； ②外源DNA高效复制； ③无限制修饰系统； ④重组缺陷型（RecA-）； ⑤便于进行基因操作、筛选和大量繁殖； ⑥安全，对人、畜、农作物无害或无致病性； （参见P283） 二、常用的基因工程宿主 1）大肠杆菌 3）酿酒酵母 2）枯草芽孢杆菌 特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中 生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚 4）动物细胞 1）大肠杆菌： 几乎所有的有关重组DNA的研究工作均利用大肠杆菌作为克隆基因的宿主 a）条件致病菌，故存在潜在的致病性，即使非致病的菌株 仍能产生内毒素，有可能污染表达产物。 b）外源基因的表达产物，易被蛋白水解酶降解或不能正确 加工折叠。 不利之处： 2）枯草芽孢杆菌： 不存在潜在致病性，不产生内毒素，可将蛋白质分泌到培养基中，并且已有合适的质粒载体用于转化。 不足之处：质粒往往不稳定 3）酿酒酵母： 基因的表达调控以及蛋白质的翻译后加工比较接近高等 真核生物； 具有较高的安全性，用它表达生物药物时，不需进行 大量宿主安全试验。 对于高等真核生物基因组及其转录、翻译系统研究 提供了一个良好基础。 4）动物细胞： 有关人类遗传学、肿瘤、感染性疾病和生理学的许多研究均需在动物细胞特别是哺乳动物细胞中进行。 细胞培养费用昂贵、难于操作； 克隆基因的表达水平极低； 现在已开发昆虫细胞系作为一种昆虫DNA病毒（杆状病 毒）载体的克隆宿主，较易进行大规模的细胞培养。 四、外源DNA导如入宿主细胞 五、基因文库与cDNA文库的构建 六、重组体的筛选与鉴定 自学！ 第五节 基因工程的常用技术和方法 一、PCR的原理和应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 1．原理 特点：在体外模拟细胞内进行的DNA复制过程 （参见P277） 1985 → 1993 基本原理： 以待扩增的DNA为模板，由分别与待扩增DNA两侧互补的两段寡核苷酸作引物，在DNA聚合酶和4种dNTP存在情况下，经变性、退火和延伸，多次循环反复使微量的特异模板DNA片段得到大量扩增。 （参见P277最后一段） 变性： 92.5 ℃使待扩增模板DNA双链间的氢链断裂形成两条单链 退火：降低温度（55 ℃）， 使引物在低温下与模板DNA片段按碱基配对原则特异性结合，形成部分双链 延伸 ：温度升高至(70 ℃)，耐热Taq DNA聚合酶以单链DNA为模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为原料，在引物的引导下催化合成互补的DNA，即引物的延伸阶段。 （参见P278） 变性、退火和延伸三个基本步骤组成一轮循环。 每一轮循环将使样品中的模板DNA扩增一倍，经过25-35轮循环后就可使DNA扩增107~1010倍。 （参见P278） PCR技术的关键酶------耐热DNA聚合酶 1）Klenow聚合酶（大肠杆菌DNA聚合酶片段） 2）Taq DNA聚合酶（水生栖热菌（Thermus aquaticus） 中分离 ，1988年萨奇（R.K.SaiKi）） 3）pfu DNA聚合酶（火球菌（Pyrococcus Furiosus） 中分离） 4）Vent DNA聚合酶（Thermococcus litoralis） （参见P279） 本章其它有关内容 自学！ 第9章思考题 1）基因工程的基本步骤是怎样的？其中哪些需涉及 到微生物的参与？ 2）为什么说微生物学不仅为基因工程提供了理论基 础，同时也提供了操作技术？ 3）一个质粒载体需要哪些基本的遗传学元件？请