第八章基因工程概要.pptVIP

第八章基因工程及其在医药工业中的应用 第四节 目的基因制备和常用分离方法 一、已知基因的获得： （一）人工合成 ①根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。 ②适用于合成分子量较小的目的基因（100bp以内）。 （二）聚合酶链反应（PCR）P333图8-16 1、定义： 又称基因体外扩增；是在引物的介导下，通过变性、退火、延伸三步循环反应，体外快速的DNA特异性扩增技术。 2、PCR反应原理 模拟体内DNA复制过程，通过变性、退火、延伸三步反应的循环完成，靶基因的双链DNA变性为单链，特异的引物在退火过程中与单链DNA模板聚合，在靶DNA的指导下引物的3’末端延伸靶DNA的互补链，完成一个循环。理论上，每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，DNA分子扩增为2n； 高温变性：94℃，目的基因接连为单链，以作为扩增的模板； 低温复性：55～60℃，一对特异性引物分别与模板3’端互补结合； 适温延伸：72℃，延伸反应； 3、PCR产物特异性 ①模板序列：应使用纯度和浓度较高的DNA模板； ②引物：优化引物的设计 ③使用较高的退火温度，较少的循环次数； ④使用较低浓度的引物、酶和镁离子； 4、PCR反应体系 模板：DNA或RNA(逆转录合成cDNA) DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶 缓冲液系统：Tris-HCl,KCl,Mg2＋ 底物：相同浓度的dNTP 引物 5、PCR的主要用途 目的基因的克隆 基因的体外突变 DNA和RNA的微量分析 DNA序列测定 基因突变分析 二、未知基因获得 (一)基因组DNA文库：P336图8－17 采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。 基因文库（gene library）(G-文库)：是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。 基因文库含有基因组内全部基因片段，包括外显子和无表达功能的内含子序列。 每一个克隆只含有一个基因片段，应用时利用探针，从文库中钓取含有所需目的基因的克隆。 （二） cDNA文库 将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为 cDNA文库。 cDNA文库(C-文库)：是以mRNA合成的互补cDNA的随机片段的重组DNA克隆群。 cDNA文库不含内含子序列，易于表达。 具有组织细胞特异性：不同组织细胞、不同发育阶段，基因表达的情况都不相同，应选择特异表达的细胞及状态； C-文库比G-文库小得多，更容易筛选。 第五节 载体DNA与目的基因的连接 载体的选择（主要考虑以下5个条件） 1.有足够容纳目的基因的幅度 根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的载体 2.构建DNA重组体的目的 克隆选克隆载体，表达选表达载体 3.载体MSC中的酶切位点 根据克隆外源DNA的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体 4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型 5.载体克隆位点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配 DNA分子的体外重组过程示意图 一、黏性末端DNA片断的连接： 当在载体和目的基因上有相同的限制酶酶切位点时，用同种限制酶（或同尾酶）使二者产生相同的黏性末端，从而将二者连接。 同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接 1 、插入失活法（单酶切） 将外源目的基因插入载体选择性标记处，并使其失活。 P340图8－20 质粒pBR322的抗性基因筛选示意图 插入失活示意图 2、定向克隆法（双酶切） 为实现定向克隆，可采用两种不同的限制酶同时酶切，使目的基因两端具有不同的黏性末端；定向克隆法构建重组分子P341 双酶切DNA片段粘性末端的连接 3、载体5’端脱磷法 载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5’端的磷酸基团防止载体的自身环化。 重组分子在体内修复缺口 P342图8－22 二、平末端DNA片断的连接： 在载体和目的基因上没有相同的限制酶酶切位点时，采用平末端连接。 1、由连接酶进行的连接：限制酶直接切割生成平末端，或用核酸酶S1切去黏性末端的单链部分；P310 在连接时，所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度要比连接粘末端的高些 2、同聚物尾连接：P343图8－23 利用末端转移酶在载体和目的基因的3’OH上加上互补的同聚物尾，两者重组后，空隙由DNA聚合酶Ⅰ填补