7.沉析2要点分析.pptVIP

* 七 盐析法的影响因素--溶质种类 溶质种类的影响：Ks和β值 .（ Ks 值和分级范围） Ks越大，分级范围（离子强度大小）越窄，盐析分离效果越好。 * 八 盐析法应用与脱盐 应用 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 * 九 盐析注意事项与作用特点 注意事项： (1) 稳定pH 用磷酸缓冲液 （2）硫酸铵加入后体积变大 （3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度 作用特点： (1) 料液体积大大降低 (2) 作为纯化前处理或最后产物收集方法 (3) 操作简单 * 第三节 有机溶剂沉淀 概念： 在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （ 2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚 （3）疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层 * 有机溶剂中的蛋白质沉淀 * 一 常用的有机溶剂沉淀剂 * 一 常用的有机溶剂沉淀剂 1、乙醇：沉淀作用强，可与水无限互溶，沸点适中，无毒等优点，广泛用于沉淀蛋白质、核酸、多糖等生物大分子和核苷酸、氨基酸等生物小分子。?? 2、丙酮：沉淀能力大于乙醇，用丙酮代替乙醇作沉淀剂一般可以减少用量1/4~1/3，但沸点较低、挥发损失大、有一定毒性、着火点较低等缺点，其应用不如乙醇广泛。?? 3、甲醇：沉淀能力与乙醇相当，对蛋白质的变性作用比乙醇和丙酮要小，但由于毒性较大，限制了应用范围。?? 其它溶剂，如二甲基亚砜、乙腈、二甲基亚甲酰胺等也可以作为沉淀剂，但远不如乙醇、丙酮和甲醇使用普遍。 * 二 有机溶剂沉淀--溶剂选择 （1）介电常数要小 （2）致变性作用要小（甲醇） （3）毒性要小、挥发性适中 （4）水溶性要好 * 三 影响有机溶剂沉析的主要因素 （1）温度：要低温下操作（-10℃）低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）； （2）搅拌速度：散热 （3）溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反 的电荷，防止共沉现象。（pI） （4）离子强度：离子强度低有利于沉析， 0.05~0.2mol/L （5）样品浓度：0.5~2% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 （6）金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ （7）分子量相关：目标物的分子量越大，引发沉淀的非溶剂量就越少。 * 四 有机溶剂沉淀的特点 优点：（1）分辨率高； （2）溶剂容易分离，并可回收使用； （3）产品洁净； 缺点： （1）容易使蛋白质等生物大分子失活； （2）应注意在低温下操作； （3）成本高 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 * 第四节 等电点沉淀法Precipitation at IsoelectricPoint 概念： 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。 * 一、等电点沉淀概述 * 一、等电点沉淀概述 * * 一、等电点沉淀概述 * 二 等电点沉淀法的特点与注意事项 优点： 很多蛋白质的等电点都在酸性范围内,而无机酸通常价廉,并且一些酸（如磷酸、盐酸）的应用是蛋白质类食品所允许的，无需去除残余的酸。 缺点： 酸化时，易使蛋白质变性，是由于pro.对低pH比较敏感。 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 （2）溶质的稳定性 （3）盐析效应 * 三 等电点沉淀法的应用 （1）适用于疏水性强的蛋白、氨基酸、及其它两性物质的沉淀。 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，溶解度增大 （3）价廉，无毒由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用。 * 第五节 非离子型聚合物沉淀 原理： PEG 分子从溶剂排斥蛋白质，优先水合，降低水化度。 试剂： PEG（聚乙二醇）、NPEO（壬苯乙烯化氧）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯 常用的此类沉淀剂是PEG，相对分子量一般为6000沉淀蛋白较好（一般在2千～ 6千）。 * 一 非离子型聚合物沉淀的公式与影响因子 蛋白质溶解度与PEG浓度