核酸非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.docVIP

试剂等 电泳仪、电泳槽、电泳玻璃板（数套）、鲨鱼齿（67空，数条）、边条（数对）、加样枪（1ml、5ml、10μl、100μl、200μl）、脱色摇床、合适大小的托盘数个 95%乙醇、冰醋酸、纱布、医用胶布、剥离硅烷TEMED、40%丙烯酰胺尿素加μl Bind-Silane（亲和硅烷）于1ml含μl醋酸的95%乙醇中，混匀固定/脱色液硝化液染色液显色液预冷 终止显色液非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，用95%乙醇擦拭。 用 ml 95%的乙醇长玻璃短玻璃1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃面，1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃面，用ml 95%的乙醇长玻璃短玻璃取0.4mm的边条，置于左右两侧，将短玻璃板压于长玻璃板上，用夹子固定住两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶封住玻璃板底部，用胶带密封；将玻璃板小角度倾斜放置，准备灌胶。 （2）制胶：称取尿素21g加入双蒸水加热溶解，待冷却后加入10ml 5×TBE，7.5ml 40%丙烯酰胺，225μl 10%过硫酸铵和50μl TEMED，，准备灌胶。 （3）灌胶：将制备的胶液沿玻璃板缓慢胶板的空隙，注意不能在胶中形成气泡。胶灌满后，将鲨鱼齿的平端插入胶液下5mm左右，同时防止平端下方出现气泡，于室温下静置h，使胶完全聚合。 （4）预电泳：撕去胶布，拔出，用蒸馏水玻璃板、梳子。1×TBE至没过1×TBE至没过反转，将鲨鱼齿插入凝胶胶面下约0.5mm，梳齿间即加样孔。120w恒功率，预电泳30min。 （5）点样：点样前用加样枪吹吸每个上样槽，将吸干净，以利于样品更好的沉降。把DNA样品与上样缓冲液混合，每个加样孔加5~7μl的扩增产物。 （6）电泳：140-160w恒功率电泳，待溴酚蓝至胶的四分之三处时（大约需要1.5~2h），终止电泳电泳液，取下胶板，将两块玻璃板轻轻分开，胶留在长玻璃板上。 银染 （1）固定（脱色）：在托盘1中加入1L固定/脱色液，将有胶的玻璃板胶面向上放入托盘中，置于脱色摇床上摇10min。（2）洗胶：在托盘2中用1L漂洗凝胶。 （3）硝化：在托盘3中用1L硝化液硝化凝胶min。 （4）洗胶：在托盘中漂洗凝胶。 （5）染色：在托盘内加入1L染色液，将胶板放入托盘中摇15min。 （6）显影：从染色液中取出胶板，立即将胶板置于显色液中摇显色，直至胶上所有的条带都出现。 （）定影（终止显色）：从显影液中取出胶板放入终止min以终止显色。 （）洗胶：将胶板置于自来水下冲洗。 （）干胶：室温下自然干燥，用扫描仪记录结果。