印迹杂交技术技术方案.pptVIP

第八章 印迹杂交技术 第一节 核酸分子杂交的基本原理 基本概念: 核酸分子杂交: 将一种核酸单链标记成为探针．再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源双链核酸分子的过程。 杂交体:杂交形成异源双链核酸分子 核酸分子杂交技术: 单链的核酸分子在合适的温度和离子 强度下，通过碱基互补形成双链杂交体的 一类技术。 核酸杂交技术： 分子探针:带有某种标记物的分子 如核苷酸链片段 核酸分子杂交的基本原理 DNA变性: 融解温度(Tm值):50％DNA变性的温度 DNA复性: 核酸杂交： 第二节 探针与标记 一、探针的基本条件 ①带有标记物，便于分析杂交体 ②为单链核酸，双链核酸探针使用前需变性解链 ③具有高度特异性，只与待测核酸杂交 ④探针序列通常是基因编码序列，因为非编码序列特异性低 ⑤探针标记灵敏度高而稳定，标记方法简便而安全 二、探针的种类 1.基因组DNA探针 2. RNA探针 3. cDNA探针 4.寡核苷酸探针 ⒈ 基因组DNA探针 基因组DNA探针多为某一基因的全部或部分序列，是最常用的DNA探针。 注意:由于真核生物基因组中存在高度重复序列，制备基因组DNA探针应当尽可能选用编码序列，避免选用非编码序列，因为非编码序列特异性低，会得到假阳性的结果 2. RNA探针 RNA探针是单链探针，和单链DNA探针相比，RNA探针具有成本低和易纯化等优点 3. cDNA探针 cDNA探针不含内含子等非特异性序列，故特异性高，是一种较为理想的核酸探针；但cDNA不易制备，因而应用受到限制 4. 寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是人工合成的DNA探针，其优点是可以根据需要随心所欲地合成，避免选用非特异性序列。大多数寡核苷酸探针长度只有15～30nt，只要其中有一个碱基不配对就会影响杂交，因而特别适合于分析点突变。另外，寡核苷酸探针的复杂性较低，因而杂交所需时间较短 三、探针标记物： ㈠放射性同位素标记物 用于标记的有32P、3H和35S等 优越性： ①灵敏度极高 ②不影响各种酶促反应，也不影响碱基配对的特异性和稳定性 ③具有很高的特异性，假阳性的结果比较少 局限性： ①必须随用随标记； ②污染环境，同时容易对操作者产生一定程度的伤害 ㈡非放射性标记物  四、探针标记的方法 1.切口平移标记法 2.随机引物标记法 3.PCR标记法 4.末端标记法 （一）缺口平移标记法 （二）随机引物标记法 （三）PCR标记法 以四种dNTP（其中一种为标记dNTP）为底物，扩增产物即为标记DNA，可作探针使用，其灵敏度和特异性很高。PCR标记法特别适合于合成短序列探针 （四）末端标记法 五、探针纯化 1.乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片 段，而dNTP等小分子物质 则留在上清液中。 沉淀2～3次即可将探针片段与杂质 分离，达到纯化探针的目的 2. 凝胶过滤法　利用凝胶的分子筛特 性，将大分子与小分 子有效分离。 第三节 核酸分子杂交的基本过程 ⒈样品制备　 印迹杂交的前提是获得具有一定 纯度和完整性的核酸 ⒉电泳分离　 通过琼脂糖凝胶电泳将待测核酸片段按大小分离，然后进行杂交。 ⒊印迹(转膜)　 将凝胶中的核酸片段转移到固相膜上，转移后各待测核酸片段在固相膜上的相对位置和在凝胶中的相对位置一样。此过程最重要的是要保持核酸片段的相对位置不变。 固相膜：硝酸纤维素膜、尼龙膜 活化滤纸 印迹方法 毛细管虹吸转移法（毛细转移） 真空转移法 电转移法（电泳转移） （1） 毛细管虹吸转移法 （2）真空转移法 （3） 电转移法 核酸的固定 烘烤：80℃ 2小时 紫外线固定：几分钟 碱固定：使用碱溶液转印DNA或 RNA过程中，DNA或RNA可以自动地共价地结合到带正电荷或不带电荷的尼龙膜上。 ⒋预杂交 将固相膜上能够结合核酸的位点全部封闭　 能够结合核酸片段的固相膜同样能够结合探针，为了减少非特异性杂交，消除本底，必须将固相膜上能够结合核酸的位点全部封闭。这样在接下来的操作中，探针将只能与待测核酸杂交。